鲎试剂致职业性呼吸道过敏症

杨黎鸿，徐迎阳，关 凯，李俊达，李丽莎，王子熹，崔 乐

职业性呼吸道过敏性疾病指从业者在接触工作环境中的职业性有害物质而引起的气道变态反应性疾病，可以表现为过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、气道高反应、工作相关性哮喘等。通常可将诱发职业性呼吸道过敏性疾病的有害物质按照分子量分为两大类[1-3]：一类为高分子量物质，多为蛋白质及糖肽，如动物性或植物性产品、真菌、蛋白酶等，它们通过IgE介导的变态反应而诱发气道症状，也是引发职业性呼吸道过敏性疾病的主要致敏物质。另一类为低分子量物质，如二异氰酸盐、酸酐类、丙烯酸单体、金属盐类、药物等，其中少部分可作为半抗原，通过与血清白蛋白结合而引发I型变态反应，但大部分此类物质的致病机制不清，但认为与IgE无关。

随着工业、经济的快速发展，以及健康意识的不断提高，可诱发职业性呼吸道过敏性疾病的变应原种类不断增加，也随之得到更多的社会关注与重视。由于职业环境中暴露因素复杂，鉴定潜在致病变应原并非易事。目前常用于鉴定变应原的方法包括支气管激发试验(包括实验室激发和作业现场激发)、变应原特异性IgE检测以及皮肤试验。

鲎试剂主要用于检测细菌内毒素及真菌葡聚糖，被广泛应用于药品及食品工业中。本文报道2例长期从事内毒素检测的实验室工作人员，在接触鲎试剂后快速出现鼻结膜炎或哮喘表现，通过皮试及现场激发诊断为鲎试剂引发的职业性呼吸道过敏症，并通过血清学实验初步分析了鲎试剂中的致敏蛋白条带。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究2例可疑鲎试剂过敏患者来自北京协和医院变态反应科门诊。试验前2例患者均签署了知情同意书。2例患者为同一药厂实验室技术人员，其主要工作内容为使用鲎试剂检测内毒素，每日需配制鲎试剂6～40安瓿不等。

例1，女，32岁，从事鲎试剂相关工作10年。近半年患者反复在配制鲎试剂后出现发作性喷嚏、流涕伴鼻痒、眼痒，严重时有胸闷、喘息，常在接触鲎试剂数分钟至2 h内发作，症状持续数十分钟至数天不等，可自行缓解。患者平日换床单时可诱发喷嚏，未重视。既往诊断镍金属过敏，否认其他特应性疾病史。

例2，女，39岁，从事鲎试剂相关工作8年。近4年出现发作性喷嚏、流涕伴咳喘，症状均在配制鲎试剂后出现，初期仅有鼻痒、耳痒、眼痒，近3年加重并逐渐出现咳嗽、胸闷。脱离工作环境后数小时可自行缓解，按需使用沙丁胺醇气雾剂。既往患秋季花粉症，苹果、桃、樱桃、芒果、榛子等多种食物过敏，青霉素过敏。

1例无特应性疾病史的志愿者作为健康对照。

1.2 方法

吸入性变应原皮内试验：试剂均来自北京协和医院变应原制剂室，常规30项吸入变应原包括室内尘土、粉尘螨、夏秋季花粉Ⅰ、夏秋季花粉Ⅱ、春季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、春季花粉Ⅲ、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ、大籽蒿、豚草、桑蚕丝、荞麦皮、混合羽毛、狗毛、多价昆虫、圆柏、蟑螂、枝孢芽枝菌、猫毛、白腊树、地肤、臭椿、法国梧桐、葎草、互隔交链孢。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用0.01 mg/ml磷酸组胺溶液，15 min后判读结果[4]。

鲎试剂：采用2例患者所属实验室提供的鲎试剂(湛江博康海洋生物有限公司，中国)。

鲎试剂皮肤点刺试验：将鲎试剂按配制步骤溶于0.1 ml去离子水中，稀释成0.25 EU/ml，使用该稀释液在2例患者及1例健康志愿者前臂屈侧进行皮肤点刺试验。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用10 mg/ml磷酸组胺溶液，15 min后判读结果。

鲎试剂现场激发试验：在配备抢救药物和设备的激发单元分别对2例患者进行鲎试剂现场激发试验。患者模拟在实验室配制鲎试剂的过程：开启6个安瓿，使用加样器各加入纯净水0.1 ml，然后将配制好的鲎试剂运送5 m距离(现实配制是在配制完成后放置于5 m外冰箱内)。整个操作大约持续10 min。记录患者症状和体征，操作前和操作后15 min进行肺功能检测、鼻阻力。

鲎试剂蛋白电泳和免疫印迹：鲎试剂水溶液经4%～12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，后使用考马斯亮蓝染色2 h，脱色至背景干净。通过半干法将蛋白转移至PVDF膜上。将膜于5%牛奶封闭2 h。PBST洗涤膜3次，每次5 min。使用PBST将患者血清按1∶4稀释，加入膜上，4 ℃孵育过夜。孵育完成后PBST洗涤3次，每次5 min。加入HRP标记的鼠标抗人IgE(Abcam，ab99806)室温孵育1 h。PBST洗涤3次，每次5 min。电化学发光法显色。

2 结果

2.1 吸入性变应原皮内试验

例1常规30项吸入性变应原皮内试验提示粉尘螨、桑蚕丝阳性。

例2常规30项吸入性变应原皮内试验提示粉尘螨、夏秋季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、多价真菌Ⅲ、大籽蒿、圆柏、葎草、地肤阳性。

2.2 鲎试剂皮肤点刺试验

两例患者鲎试剂皮肤点刺试验均为阳性，而健康对照鲎试剂皮试为阴性(图1)。

2.3 鲎试剂现场激发试验

例1 患者在鲎试剂配制完成后6 min出现鼻痒、流涕，30 min出现眼痒，症状在1 h左右消失。例2 患者在鲎试剂配制完成后10 min出现鼻痒、眼痒，1 h出现咽痒、咳嗽、胸闷。未给予药物治疗，症状在1 h 20 min消失。1例健康对照在配制鲎试剂后无任何不适症状。

两例患者通气功能及鼻阻力检查均未出现阳性改变。

2.4 蛋白电泳和免疫印迹

经SDS-PAGE电泳，鲎试剂在相对分子质量10 000～185 000间可见10余条蛋白条带(图2)。使用鲎试剂及2例患者血清进行免疫印迹分析，结果显示例1血清IgE主要与相对分子质量20 000、185 000蛋白条带结合，例2血清IgE可与相对分子质量20 000、25 000、40 000蛋白条带结合(图3)。健康对照者血清无明显条带出现。

2.5 转归

2例患者均被诊断为鲎试剂引发的职业性呼吸道过敏反应。建议患者避免继续接触变应原。但因个人原因，例1难以脱离接触环境，嘱其在日常鲎试剂配制过程中加强了个人防护，包括佩戴口罩及在生物安全柜中操作以减少变应原的接触。例2在确诊后很少进行鲎试剂相关操作。此后两例患者极少在工作环境中再出现呼吸道过敏症状。

3 讨论

鲎，是一种古老的海洋生物，主要分布于北美大西洋沿海及亚洲部分沿海地区[5]；通常也被称为马蹄蟹，体长可达60 cm，体重3～5 kg，体表覆盖有几丁质外骨骼，头胸部具有发达的马蹄形背甲；平时钻入海沙生活，退潮时在沙滩上步行。1956年Bang[6]首次报道了给鲎注射革兰阴性菌后鲎很快因血液凝固而死，而后发现革兰阴性菌细胞膜上的内毒素激活了鲎血液中的一种酶。基于这一特点，鲎的血液冻干粉被制成鲎试剂，作为一个极敏感的测试内毒素的方法被广泛应用。对于从事鲎试剂相关工作的职业者，它也可成为引发职业性呼吸道过敏性疾病的潜在病因。

图 1鲎试剂皮肤点刺试验

Fig1Skin prick test with Tachypleus Amebocyte Lysate

图 2 鲎试剂SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis of Tachypleus Amebocyte LysateMr:相对分子质量

图 3 免疫印迹结果Fig 3 Western blot of Tachypleus Amebocyte Lysate with patients’ sera其中条带1为例1，条带2为例2，条带3为健康对照Mr:相对分子质量

随着工业化进程，职业性呼吸道过敏症已成为常见的呼吸系统疾病之一。呼吸道过敏症可以表现为过敏性鼻炎/结膜炎、支气管哮喘，逾80%支气管哮喘患者同时并发过敏性鼻炎，15%支气管哮喘成人患者被认为与工作接触有关[7-8]，其中绝大多数证实为IgE介导[9]。呼吸道过敏症的出现通常需要一定的致敏期，且致敏原多为高分子物质。发生呼吸道过敏症风险较高的职业包括面包师、汽车油漆工、理发师和木材加工者，容易致病的过敏原包括小麦面粉、异氰酸盐、过硫酸盐、橡胶和醛类[10]。职业性呼吸道过敏症除了疾病诊断外，最重要的是病因学诊断，可以采用皮肤试验(点刺试验或者皮内试验)、特异性IgE检测、激发试验(变应原鼻黏膜激发试验，变应原支气管激发试验，现场激发试验等)[11-12]。Li等[13]使用现场激发试验确诊并在国内首次报道吸入蜂王浆致职业性过敏性哮喘1例。

Ebner等[14]曾于1992报道过1例鲎试剂所致的速发型变态反应。与本文相似，该报道中患者亦为药物实验室技术人员，主要从事内毒素检测工作。作者通过皮肤点刺试验及ELISA的方法确诊患者为鲎试剂引发的IgE介导的I型变态反应。

本文在国内首次报道了鲎试剂这一罕见变应原引发的呼吸道过敏反应。2例患者分别是在接触鲎试剂9年及4年后发病，主要表现为在配制鲎试剂后数分钟内出现的过敏性鼻炎、结膜炎及哮喘症状。鲎试剂皮肤点刺试验阳性，现场激发试验可诱导症状出现。提示这2例患者临床表现为鲎试剂引发的I型变态反应。鲎试剂现场激发试验中客观观测指标(鼻阻力及肺功能)未能达到阳性诊断标准。出于患者安全考虑，本研究现场激发试验是在诊室中完成，而非患者实际工作场所，可能导致患者变应原暴露量及暴露时间低于实际工作场所，故而出现阴性结果。

2例患者分别并发粉尘螨、花粉过敏，提示职业性呼吸道过敏症的出现可能与特应性体质密切相关[15-16]。2例患者均无虾蟹等甲壳类食物过敏史，与Ebner报道[14]相似，未发现鲎试剂与甲壳类食物存在交叉过敏。即使在脱离存在致敏原的工作环境，部分职业性呼吸道过敏症患者的症状也可能持续数年，这可能与延误治疗、气道重塑以及非特异性炎症相关，所暴露的职业变应原复杂、具有特应性体质、特别是不能调离原工作环境、用药不规范的患者往往预后很差[17]。此2例患者均并发其他类吸入性过敏原，具有特应性体质，如有可能应尽早脱离现有工作岗位，并积极治疗并发过敏性疾病。

本文通过免疫印迹方法对鲎试剂中潜在致敏蛋白进行初步分析，结果显示例1患者血清IgE可与鲎试剂中相对分子质量20 000、185 000蛋白条带结合，例2在相对分子质量20 000、25 000、40 000存在特异性IgE结合条带。鲎试剂的主要功能蛋白是凝固蛋白原(凝胶形成)、凝固酶原(丝氨酸蛋白酶)、B因子(丝氨酸蛋白酶)、G因子(丝氨酸蛋白酶)和C因子(丝氨酸蛋白酶)，相对分子质量分别为20 000、54 000、64 000、110 000、123 000，2例患者都能显示出相对分子质量20 000结合条带，推测相对分子质量为20 000的凝固蛋白原是鲎试剂的致敏蛋白。因病例数量少，难以确定鲎试剂中主要致敏蛋白所对应相对分子质量蛋白条带。

职业性呼吸道过敏性疾病不仅仅是一种临床疾病，因其涉及劳动保护及工伤赔偿等法律内容，而成为复杂的社会问题。早期发现并脱离变应原环境、减少变应原接触对职业性呼吸道过敏性疾病的治疗具有重要意义。因此，准确鉴定变应原对临床医生是一项艰巨的挑战。目前可采取的病因学诊断方法包括皮肤试验(点刺试验或者皮内试验)、特异性IgE检测、激发试验(变应原鼻黏膜激发试验，变应原支气管激发试验，现场激发试验等)[8-9]。部分职业性呼吸道过敏性疾病患者的症状在脱离存在致敏原的工作环境后仍可能持续数年，且对于所暴露的职业变应原复杂、具有特应性体质、特别是不能调离原工作环境、用药不规范的患者往往预后很差[13]。因此，除脱离原工作岗位外，规范的药物治疗同样重要。

本研究为鲎试剂所致职业性呼吸道过敏症的国内首次报道，并在国内外首次就鲎试剂致敏蛋白做了初步分析，推测相对分子质量为20 000的凝固蛋白原可能是其致敏蛋白。内毒素检测在药物及食品领域广泛应用，故接触鲎试剂的工作人员均存在发展为职业性呼吸道过敏症的风险。因此，需要对鲎试剂所致职业性过敏进行更为深入的研究，如易感人群、致敏蛋白组分、致敏途径、预防措施等。