粉尘螨1组主要变应原(Der.f 1)含量测定体系比较

张 影，鲁 旭，王 斌，曾 明

尘螨过敏是最常见的过敏性疾病，而屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)是导致尘螨过敏症最常见的螨虫物种，当前的螨变应原制品均是以屋尘螨和/或粉尘螨的纯种培养物为原材料制备而成的[1-2]。螨变应原制品成分复杂，屋尘螨和粉尘螨的1组和2组变应原(Der.f1、Der.f2；Der.p1、Der.p2)是目前公认的有效变应原成分，并且至少60%的尘螨过敏患者对这两种主要变应原发生反应[3-6]。有研究表明90%尘螨过敏患者的血清与Der.f1具有免疫反应，因此粉尘螨1组主要变应原(Der.f1)是目前国际公认的粉尘螨变应原制品中的关键活性成分，且有研究认为其含量直接关系到制品的总生物学效力[3]。

目前各国研究机构均采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，sELISA)测定Der.f1含量，该检测方法既需要Der.f1含量明确的抗原标准品，也需要适宜的Der.f1特异性的包被抗体和检测抗体[7-10]。中国目前批准上市的粉尘螨变应原制品均须进行Der.f1含量的测定，但是中国尚未建立相应的国家标准品，各企业Der.f1含量测定标准品及检测用的抗体系统均不同，这种主要变应原含量测定抗原及抗体系统多样化的现状增加了制品间质量差异较大的风险。已有研究报道采用不同的主要变应原含量测定体系测定同一种变应原提取物中的主要变应原，测定结果存在一定的差异[9]。为了探索统一抗原、抗体标准品，及检定方法对主要变应原Der.f1含量进行标准化测定是否具有可行性，本研究采用上述3种不同来源的Der.f1抗原标准品及特异性检测抗体分别测定来自3家企业的粉尘螨变应原制品中的Der.f1含量，比较这些检测系统所测定结果的异同，探索建立Der.f1含量测定用抗原、抗体国家标准品是否具有可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

酶标仪，为MD公司产品。洗板机，为Thermo公司产品。

Der.f1含量测定用标准品分别来自A企业(ST-H011,Der.f1含量为6 μg/瓶)，B企业(MS-14，Der.f1含量为73.2 μg /瓶),Indoor公司(EL-UAS，Der.f1含量为2.5 μg /ml)；Der.f1检测用包被抗体/检测二抗分别来自C企业(14-1/12G2(辣根过氧化物酶标标记))、A企业(5-17/Der1-BD(生物素标记))、Indoor公司(6A8/4C1(生物素标记))；粉尘螨变应原原液(生产批号：20170201)，由C企业提供；粉尘螨皮肤点刺液分别来置A企业(批号：M3781，简称ASPT)和B企业(编号：708，简称MSPT)；Streptavidin-HRP(货号：S5512)，购自Sigma；牛血清白蛋白，购自索莱宝；0.01 mol/l PBS缓冲液，购自HYCLONE；TMB显色液，购自AMRESCO；高蛋白吸附聚苯乙烯平底96孔酶标板，购自Costa。

1.2 试验方法

1.2.1 ELISA法测定Der.f1含量

各企业的Der.f1抗原标准品和样品的稀释参照其提供的说明。Der.f1含量测定按如下经优化的通用方法进行测定：96孔酶标板中加入2 μg/ml的Der.f1测定用包被抗体，100 μl/孔，贴好封板膜后于2～8 ℃过夜；第2天洗板后，每孔加入200 μl封闭液 (1% BSA-0.01 mol/l PBS, pH 7.4)，于室温下振摇封闭约1 h；洗板；加入系列稀释的标准品及待测样品100 μl，贴上封板膜后，于37 ℃下孵育1 h；孵育结束后取出酶标板洗板，每孔加入100 μl检测二抗(1∶1 000倍稀释)，37 ℃孵育1 h；采用C企业的抗体检测体系时，洗板后，每孔加入100 μl TMB显色液，室温下避光孵育10～20 min。每孔加入 100 μl浓度为2M的H2SO4终止液，利用ELISA酶标仪读取450 nm波长下的光密度值。采用Indoor公司和A企业的抗体系统时，检测二抗孵育及洗板后，加入100 μl链霉亲和素-HRP偶联二抗(1∶5 000倍稀释)，37 ℃孵育1 h，洗板后，每孔加入100 μl TMB显色液，室温下避光孵育10～20 min。每孔加入100 μl浓度为2M的H2SO4终止液，利用ELISA酶标仪读取450 nm波长下的光密度值。

1.2.2 3种Der.f1含量测定标准品通用性比较

按照1.2.1中方法,利用6A8/4C1抗体检测系统，分别以ST-H011、MS-14、EL-UAS为标准品,测定这3种标准品中的Der.f1,重复测定3次，选择线性测定范围内、连续2个稀释度下的测定结果，取平均值，计入最终结果计算。将每个标准品的测定值与其标示值进行比较，分析这3种标准品是否具有通用性。进一步利用上述3种标准品测定C企业粉尘螨原液中的Der.f1的含量，比较测定结果的一致性。

1.2.3 3种Der.f1含量测定用抗体系统的比较

进一步利用6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/Der1-BD 3种抗体系统，按照1.2.1中方法，以ST-H011、MS-14为标准品,互测其Der.f1含量,重复测定3次，将每个标准品的测定值与其标示值进行比较，分析这3种抗体系统的通用性。

1.2.4 适用性分析

以ST-H011、MS-14为标准品，利用6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/Der1-BD 3种抗体检测体系，分别测定A企业、B企业粉尘螨变应原制品及C企业粉尘螨原液中的Der.f1含量，连续测定3次，对测定结果进行比较，探索上述Der.f1含量测定用抗原标准品和抗体系统的适用性。

1.3 统计学分析

利用GraphPad Prism 5.2对测定结果进行one-way 和two-way ANOVA分析。

2 结果

2.1 3种抗原标准品中Der.f 1含量赋值比较

利用Indoor的6A8/4C1作为检测抗体,分别以ST-H011、MS-14、EL-UAS为标准品，测定ST-H011、MS-14、EL-UAS中Der.f1含量，其测定值与标示值的比值结果显示，ST-H011与MS-14用于测定Der.f1含量具有较好的通用性，两者作为标准品时，ST-H011、MS-14、EL-UAS的测定/标示值无显著差异(0.055≤t≤1.631，P>0.05)，其中ST-H011、MS-14的测定结果较准确，测定值/标示值的比值均接近1，EL-UAS的测定结果误差较大，测定值/标示值全部大于2(图1A)。EL-UAS与其他两种标准品的赋值存在较大差异，用其作为标准品时，ST-H011、MS-14与EL-UAS的测定值/标示值比值差异均显著(2.7≤t≤11.62，P<0.05)，且ST-H011、MS-14的测定值/标示值中最低为0.1(图1A)，表明ST-H011、MS-14与EL-UAS的赋值存在差异。进一步用ST-H011、MS-14、EL-UAS作为标准品测定C企业的粉尘螨变应原液，结果以ST-H011和MS-14为标准品时，C企业粉尘螨原液中Der.f1含量分别为(56.74±7.98)μg/ml和(57.48±4.49)μg/ml，两个测定值间没有显著差异(q值为0.3295，P>0.05)。以EL-UAS为标准品时，C企业粉尘螨原液中Der.f1含量为(14.9±1.13)μg/ml，与前两个结果的差异显著(q值分别为19.05、19.38，P<0.05)(图1B)。进一步表明ST-H011与MS-14用于测定Der.f1的含量，具有较好通用性。

2.2 3种抗体系统用于Der.f 1含量测定比较

进一步利用3种Der.f1特异性抗体检测系统(14-1/12G2、6A8/4C1和5-17/Der1-BD)，分别以ST-H011和MS-14为标准品，互测其Der.f1的含量。以ST-H011做标准曲线时(图2A)，6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/DER1-BD 3种抗体系统测定MS-14 中的Der.f1值分别为(93.7±5.833)μg/ml、(74.1±5.188)μg/ml、(83.9±2.853)μg/ml，与标示值(73.2 μg/ml)的比值分别为1.28、1.01、1.15，其中14-1/12G2抗体测定MS-14中Der.f1值最接近标示值，6A8和5-17的测定值偏离相对较大，但3个抗体测定的测定值与标示值的比值均在0.5～2.0范围内(现阶段各国均规定Der.f1含量应为标示量的50%～200%)。以MS-14为标准品(图2B)，6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/DER1-BD 3种抗体测定ST-H011中Der.f1值分别为(4.6±0.196)μg/ml、(6.1±0.309)μg/ml、(5.3±0.213)μg/ml，与标示值(6.0 μg/ml)的比值分别为0.77、1.01、0.88，其中14-1/12G2抗体测定的Der.f1值最接近标示值，其次是5-17/DER1-BD抗体组，6A8/4C1抗体组的测定结果偏差较大，但是3种抗体系统测定的Der.f1的标示值与测定值的比值亦均在0.5～2.0范围内。本研究结果表明3种Der.f1含量测定用抗体系统具有较好的通用性，其中14-1/12G2通用性最好。

图 13种Der.f1含量测定用标准品通用性分析

Fig1General analysis of 3 standard products for determination ofDer.f1content

A:3种Der.f1标准品互相标定的结果分析; B:3种标准品测定C企业粉尘螨原液中Der.f1含量的比较

2.3 Der.f 1含量测定用抗原、抗体系统的适用性分析

利用3种Der.f1特异抗体测定系统(14-1/12G2、6A8/4C1和5-17/Der1-BD)及2种抗原标准品(ST-H011，MS-14)分别测定A和B两家企业粉尘螨变应原制品(ASPT，MSPT)中的Der.f1含量，结果见图3A和图3B，所测得的Der.f1含量菌符合ASPT和MSPT的质量标准规定(其中ASPT标准规定Der.f1含量应为5～20 μg/ml；MSPT标准规定Der.f1含量应为6.1～24.4 μg/ml)，表明上述检测体系具有较好的适用性，其中利用14-1/12G2作为检测抗体测定ASPT中Der.f1含量(图3A)，两种抗原标准品的测定结果一致性最好，差异不显著(t=0.8798，P>0.05)；利用6A8/4C1和5-17/Der1-BD作为检测抗体测定ASPT中Der.f1，两种标准品所测定的Der.f1值虽仍在质量标准规定范围内，但存在差异(t值分别为8.935,5.409；P<0.001)。同样，利用14-1/12G2作为检测抗体测定MSPT中Der.f1含量(图3B)，两种抗原标准品的测定结果一致性最好，没有显著差异(t=2.039，P>0.05)；利用6A8/4C1和5-17/Der1-BD作为检测抗体测定MSPT中Der.f1，两种标准品所测定的Der.f1值虽然仍在质量标准规定范围内，但测定结果均存在差异(t值分别为5.995,7.596；P<0.001)。进一步利用三种抗体及2种抗原标准品测定C企业粉尘螨原液中的Der.f1含量，结果14-1/12G2抗体组中，两种抗原标准品的测定结果一致性最好，没有显著差异(t=0.055，P>0.05)，6A8/4C1组及5-17/Der1-BD抗体组中，两种抗原准品的测定值间差异显著(t分别为2.689、3.807，P<0.05)(图3C)。

本研究的结果进一步证明以14-1/12G2作为检测抗体测定不同企业粉尘螨变应原样品中的Der.f1，适用性最好。

3 讨论

对不同地域尘螨过敏患者的研究表明：对尘螨1组和2组主要变应原(Der.1和Der.2)过敏的患者占尘螨过敏总人口的比例均非常高，这种不同地域尘螨过敏模式高度相似的现状表明Der.1和Der.2的含量稳定对于确保尘螨变应原制品质量安全和有效具有重要提示意义[11]。就螨变应原制品目前的现状而言，不同厂家螨虫培养及生产工艺均存在一些差异，从而导致螨变应原提取物的蛋白组分差异较大[6, 12]，甚至同一厂家生产的不同批次制品之间，主要变应原含量和组分均存在较大差异[13-14]，甚至采用不同的螨变应原抗原标准品和抗体检测体系，测定同一种螨变应原提取物，所测得的结果也不相同，因此对主要变应原含量测定进行标准化越来越被认为是尘螨变应原制品质量控制的一个关键要素[9, 15]。

图 23种抗体系统检测两种标准品中Der.f1含量的结果

Fig2Results of determination ofDer.f1content in two standard products by three anti-system

A:以ST-H011为标准品测定MS-14中Der.f1含量; B:以MS-14为标准品测定ST-H011中Der.f1含量

图 3抗原标准品及抗体系统测定粉尘螨变应原制品中Der.f1含量的适用性分析

Fig3Applicability of antigen and antibody standards for determination ofDer.f1content in dermatophagoides farinae allergen products

A:3种抗体系统及两种企业抗原标准品测定ASPT中Der.f1含量; B:3种抗体系统及两种企业抗原标准品测定MSPT中Der.f1含量; C:3种抗体系统及两种企业抗原标准品测定C企业粉尘螨原液中Der.f1含量

中国市售的粉尘螨变应原制品主要来自3家企业，各企业标准中均规定需测定制品中Der.f1含量，而测定用抗原标准品和抗体系统主要由各企业提供，且各企业均不相同。A企业采用自主研制的企业内部抗原标准品(ST-H011)和抗体系统(5-17/Der1-BD)；B企业也是采用其自主研制的企业内部抗原标准品(MS-14)，抗体系统则采用Indoor公司的(6A8/4C1)；C企业采用INDOOR公司抗原标准品(EL-UAS)和抗体系统(6A8/4C1)，C公司近期又新研制了一套Der.f1特异性的抗体检测体系，即14-1/12G2，拟用于Der.f1的含量测定。因此中国亟需建立尘螨变应原含量测定国家标准品。

为了促进中国尘螨变应原制品质量的标准化，本研究首先对中国市售粉尘螨变应原制品中Der.f1含量测定用的3种抗原标准品进行的综合比较分析,结果证明Indoor公司的抗原标准品中Der.f1赋值与A、B两家变应原制品生产企业内部标准品的赋值差异较大,用其测定其他两家企业的内部标准中Der.f1值，测定结果比标示量会低3～4倍，用其测定C企业粉尘螨变应原原液中Der.f1含量，测定值比A和B企业标准品所得到的测定值低3倍。Indoor公司Der.f1含量赋值低于其他的抗原标准品的其他研究也有报道[9]，Indoor公司认为其Der.f1含量低于同类标准品可能是因为其他标准品中的Der.f1赋值偏高[15-16]。由于缺乏Der.f1含量测定用的国际标准品，造成上述差异原因还无法定论，但是这种Der.f1抗原标准品的赋值差异直接影响到制品中Der.f1的真实含量，进而对临床诊断和治疗也产生干扰和影响。虽然EL-UAS作为天然纯化的纯品蛋白，用于Der.f1含量测定具有一定的优势，但是因其赋值与其余2家企业Der.f1含量测定标准品差异较大，若用其作为标准品，将会对多家企业的现有标准产生较大影响。并且多家企业均反馈El-UAS的批间稳定性较差。而ST-H011和MS-14中的Der.f1的赋值具有较好的通用性，用其评价不同来源的粉尘螨变应原制品，测定结果均具有可比性，因而这两种Der.f1含量测定用企业标准品具有较好的适用性，未来用其对中国Der.f1测定用候选国家标准品的含量进行赋值，对中国目前市售的粉尘螨变应原制品的质量标准不会产生过于明显的影响。但是这两种企业标准品也存在一定不足，即它们均不是纯蛋白，而是从粉尘螨纯种培养物中提取的天然蛋白混合物。在今后的研究中，亟需制备纯化的Der.f1抗原，尽可能客观公正的对Der.f1进行准确赋值，促进中国粉尘螨变应原制品中Der.f1抗原标准品的建立。

Der.f1含量测定主要采用双抗体夹心ELISA法，除了上述抗原标准品外，适宜的抗体检测系统也是确保主要变应原蛋白能被准确测量的关键指标。本研究对3种Der.f1特异性抗体标准品进行系统的比较分析，发现3种Der f1特异性抗体系统具有较好的通用性，与不同来源的粉尘螨变应原提取物的特异性结合能力基本一致，对主要变应原含量的测定结果影响较小，但是14-1/12G2抗体系统的测定结果最稳定，未来可作为中国Der.f1含量检测用抗体国家标准品研制的最佳候选。

总之，本研究结果证明，利用2种企业Der.f1抗原标准品及3种抗体检测系统测定不同来源粉尘螨变应原提取物中Der.f1含量，均具有较好的通用性和适用性，其中用14-1/12G2抗体系统进行检测时，2种抗原标准品所测定的各制品中的Der.f1含量结果偏差均最小，一致性最好。14-1/12G2未来可作为Der.f1含量测定用抗体国家标准品的候选。本研究为中国粉尘螨变应原制品中Der.f1含量标准化奠定初步基础。