γ分泌酶抑制剂DAPT对过敏性鼻炎小鼠模型的影响及作用机制

刘亮亮，祝 康，夏 翠，庄鹏晖，郑国玺，王正辉

过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是发生在鼻黏膜的Ⅰ型变态反应性疾病,是鼻炎中最常见的类型。其发病机制涉及大量细胞因子和炎症介质，是多因素多环节共同作用的结果。有研究证实:AR患者体内存在庞大的细胞因子、黏附分子和炎性介质网络系统，通过信号转导通路调节多种细胞的生长、代谢、增殖和凋亡等功能活动，其中Th1和Th2细胞间因子的失衡变化是引起和影响过敏性鼻炎发生发展的生理学基础[1],且细胞因子网络生成和释放与辅助性T淋巴细胞的分化方向有关[2]。研究表明Notch是一条影响细胞命运的、保守而重要的信号转导通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，参与多种组织细胞的信号识别、增殖、分化和凋亡等活动，尤其在T细胞的发育和分化过程中发挥着重要的作用。γ-分泌酶抑制剂DAPT可以通过阻止Notch胞内区(intracellular domain of notch，ICN)释放至核内，有效地治疗由Notch信号调节的疾病。γ分泌酶抑制剂DAPT可能作为宫颈癌[3]和阿尔茨海默病新的治疗手段曾受到广泛关注[4]。本实验通过建立过敏性鼻炎小鼠模型，以 Notch 受体为靶点，研究DAPT对过敏性鼻炎小鼠的影响，进一步通过测定Th1/Th2细胞相关细胞因子，阐明其可能的作用机制，为过敏性鼻炎寻求新的药物治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

7～8周龄的SPF级BALB/c小鼠32只，雌雄各半，体质量(20±2)g，购买于西安交通大学医学院实验动物中心的SPF级实验室，并按照中心管理规定饲养动物。饲养条件为25 ℃恒温，无特殊病原体(SPF)级层流室，每天光照和黑暗时间为1∶1交替，自由进食标准饲料(SPF级的固体饲料)及饮水。

1.2 试剂

高速冷冻离心机(德国Eppendorf)，卵清蛋白(Sigma)、氢氧化钠铝(天津市无力化学试剂有限公司)，DAPT(Sigma Aldrich),DMSO(Sigma)，小鼠IL-4和IFN-γ Elisa试剂盒(伊莱瑞特生物科技有限公司)。

1.3 主要溶液配制

PBS溶液：将 PBS 干粉一包溶解在900 ml 三蒸水中，用HCl调节pH值(7.2～7.4)，加入三蒸水至1 000 ml，用一次性滤器过滤，分装200 ml/瓶，4 ℃保存。

卵清蛋白混悬液：(1)腹腔注射液：卵清蛋白(ovalbumin,OVA)250 μg，氢氧化铝25 mg，溶于10 ml PBS中，配置成pH 7.4的OVA混悬液，每只小鼠腹腔注射0.4 ml/次。(2)鼻部激发液：OVA 100 mg溶于10 ml PBS中，滴鼻10 μl/侧/次/只。

DMSO混悬液：取纯DMSO液体5 ml溶解到已配制好的 PBS水中，使其终浓度为5 μmol/L混匀待用，使用前15 min内配置。

DAPT混悬液：取100 ml已配好的DMSO溶液，加入使DMSO终浓度为5 μmol/L的DAPT，混匀，现用现配。

1.4 实验小鼠分组和处理

采用随机对照原则将BALB/c小鼠等分成4组，分别为过敏性鼻炎模型组、对照组、DMSO组、DAPT组。致敏阶段：模型组小鼠第1、5、9、12天腹腔注射OVA混悬液0.4 ml/只;对照组采用PBS，其注射部位和剂量同与模型组。激发阶段：第13～20天，用含10%OVA的PBS溶液滴鼻，每天10 μl/侧。小鼠出现流鼻涕、打喷嚏、挠鼻子为阳性反应；对照组用等量的PBS滴鼻，方法同模型组。DMSO组和DAPT组小鼠在每次处理前(致敏和激发阶段)30 min腹腔注射DMSO和DAPT混悬液0.4 ml，其余处理方法同模型组。最后一次激发后12 h收集四组小鼠标本。

1.5 临床症状观察评定指标

造模第一天开始观察小鼠行为、状态、体征、摄食、饮水、大小便、体质量，每次激发后观察并记录30 min内小鼠鼻涕量、喷嚏及挠鼻的次数。采用叠加法计算总分，总分大于5分为造模成功(表1)。

表1 小鼠症状分析评分标准Table 1 Evaluation criteria for symptom analysis in mice

1.6 Elisa检测不同组小鼠外周血清IgE及血清和鼻腔盥洗液上清中IL-4、IFN-γ含量

按照Elisa试剂盒说明书操作步骤进行，用酶标仪测定后计算各组IgE、IL-4及IFN-γ的含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠鼻部临床症状评定结果及记分统计

实验前四组小鼠体重、外观、行为以及对刺激的反应活动均无明显的差异。模型组小鼠于激发第3天开始每次激发后出现短时间内的躁动、打喷嚏、抓耳挠鼻端两侧等症状，清水样鼻涕较多，20 min后逐渐好转。随着激发次数的增加，上述症状逐渐加重，并出现反应迟钝和精神不振。模型组小鼠在

最后一次激发后30 min内的症状记录评分都大于5分。对照组和DMSO组仅有轻度的抓鼻，且喷嚏少，无流涕，评分均小于5分，30 min内的挠鼻、打喷嚏次数在激发后显著低于模型组。DAPT组小鼠的症状介于两者之间，评分均小于3分(表2)。

2.2 鼻黏膜病理结果

模型组小鼠鼻黏膜上皮脱落、坏死而不连续，纤毛排列紊乱，炎细胞浸润明显，组织间隙出血、腺体增生、肿胀，杯状细胞增生，黏膜表面分泌物增多，鼻黏膜下组织间质充血水肿，小血管扩张。对照组小鼠鼻黏膜纤毛上皮完整光滑、无断裂，未见明显的炎性细胞浸润。DAPT组小鼠鼻黏膜较模型组小鼠有明显的改善，组织间隙炎性细胞浸润明显减少，腺体轻度增生，黏膜上皮部分脱落、坏死，纤毛光滑不连续，黏膜表面可见少量分泌物。DMSO组小鼠鼻黏膜组织病理形态学表现与模型组相似(图1)。

表2 各组小鼠症状记分、挠鼻、打喷嚏次数比较Table 2 Comparison of the number of scratching andsneezing in each group n=8)

2.3 各组小鼠外周血血清IgE表达

DAPT组小鼠外周血血清IgE表达量(6.741 2±0.52)ng/ml，较模型组(12.132 7±0.50)ng/ml明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组(6.007 7±0.91)ng/ml比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而DMSO组小鼠IgE的表达量(12.073 8±1.30)ng/ml与模型组相近(P>0.05)，与对照组和DAPT组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

2.4 各组小鼠IL-4表达

模型组小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清IL-4表达量较其余各组升高，与DAPT组和对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，而与DMSO组相近(P>0.05)。DAPT组小鼠IL-4表达量较DMSO组下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而与对照组相近(P>0.05)(表4，表5)。

图1各组小鼠鼻黏膜病理改变(×40)

Fig1Pathological changes of nasal mucosa in each group(×40)

A.模型组：黏膜纤毛排列紊乱、倒伏(←)；炎细胞浸润明显(△)，鼻黏膜下组织间质水肿，小血管扩张(◆)；腺体增生明显(↑); B.对照组：黏膜纤毛排列整齐，完整、光滑(←)；少量炎性细胞浸润(↑); C.DMSO组：鼻黏膜纤毛断裂、倒伏，排列紊乱(←)；黏膜层大量炎性细胞浸润(▲)，间质出血、水肿(△)； D.DAPT组：较模型组(图A)有明显的改善：复层纤毛开始修复(←)；组织间隙炎性细胞浸润明显减少(▲)，腺体增生减轻(↑)；间质水肿、出血明显减轻(△)

表3 各组间血清IgE两两比较的LSD-t统计学结果Table 3 LSD-t statistical results of pairwise comparison of serum IgE between groups

2.5 各组小鼠IFN-γ表达结果

模型组小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清中的IFN-γ表达量较其余各组明显下降。DAPT组小鼠表达量较模型组明显升高，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组接近(P>0.05)；DMSO组表达量与模型组相近(P>0.05)，与对照组DAPT组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表6，表7)。

表4 各组小鼠IL-4表达量变化Table 4 Change of IL-4 expression in mice of each n=8)

表5 各组间IL-4两两比较的Dunnett-T3统计学结果Table 5 Dunnett-t3 statistical results of pairwise comparison of IL-4 between groups

表6 各组小鼠IFN-γ表达量变化 Table 6 Change of IFN-gamma expression in mice of each n=8)

表7 各组之间两两比较的Dunnett-T3统计学结果Table 7 Statistical results of pairwise comparison of dunnett-t3 between groups

3 讨论

Notch基因于1919年首次发现于果蝇体内。已知的Notch受体有4种，Notch1～4表达于多种组织器官，其中Notch1的表达更为广泛。目前认为Notch受体在不同物种之间(果蝇到人)以及同一物种的不同成员之间都有高度的结构同源性。脊椎动物Notch配体分为Delta-like与Jagged,前者包括Delta 1/3/4,后者包括Jagged 1和2。Notch配体N端有一个结合Notch受体所必需的DSL(the ligand of Notch, Delta、Serrate、 Lag-2)基序，当配体(如Delta)和相邻细胞的Notch受体结合后, Notch受体被蛋白酶体切割，释放出具有核定位信号的胞质区ICN(intracellular domain of Notch)，进入细胞核与DNA结合蛋白CSL(CBF-1，suppressor of hairless，Lag的合称)结合，调节基因表达。Notch信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-Ioop-helix, bHIH)，它们又调节其他与细胞分化直接相关的基因的转录。Notch 2由一组高度保守的蛋白质组成，它们是细胞膜上的受体。Notch2信号转导不需第二信使和蛋白激酶的参与，可直接接收邻近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达。这些配体与相同或者不同的受体相互作用，激活Notch信号通路，参与调控多种器官、组织及细胞的生长发育，同时介导Ⅱ型炎症反应的发生发展[5]。Guo等[6]通过测定哮喘模型小鼠肺组织及肺T细胞中Notch mRNA 的表达初步判定Notch 受体在哮喘发病中发挥一定作用, 并证明Notch主要参与调节哮喘发病中T 细胞的Th2 反应, 在哮喘发病中可能起促进作用。而过敏性鼻炎与哮喘密切相关，是同一疾病在不同部位的反应，有“一个气道，一种疾病”之说，共同点是有大量的炎症介质及细胞因子的参与。前期研究中，笔者通过测定过敏性鼻炎模型鼻中隔黏膜中Notch信号通路相关基因Notch1-4 mRNA的表达初步判定Notch受体与过敏性鼻炎的发病有一定关系[7]。

Notch受体蛋白包括胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区是结合配体并激活受体的部位。Notch受体和配体结合后发生两次分裂。γ-分泌酶催化第二次分裂，释放出Notch受体胞内区(NICD)，NICD进入细胞核，然后结合到CSL，进而发挥生物学作用调节多种基因的表达[8]。有研究表明细胞表面的γ-分泌酶的蛋白水解作用是在细胞膜进行的，可以裂解细胞间的黏附结构并能释放胞间信号片段。γ-分泌酶抑制剂DAPT阻止了 Notch信号通路的活化，进一步抑制了其下游基因的表达[9]，这对过敏性鼻炎鼻腔黏膜的修复及体内过敏性相关因子数量的改变可能起着重要的作用。DAPT 是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，可阻断由γ-分泌酶介导的Notch 受体酶切过程，使Notch受体分子无法转变成有效的活性片段，从而抑制Notch 信号通路的激活，阻止Notch 的活化[10]。DAPT是被人工合成的对Notch信号途径有阻断作用的一种γ-分泌酶抑制剂，在剂量10～20 μmol/L时可阻滞NICD的产生。本实验参照DAPT产品说明书的体内建议量[5 μmol/(ml·g)]在小鼠基础致敏和激发阶段前给予DAPT混悬液，结果显示：DAPT组小鼠鼻部过敏症状明显减轻，和模型组相比，鼻中隔黏膜病理改变也明显减轻，鼻黏膜损伤开始修复，血清特异性抗体IgE的浓度也明显下降,与模型组及DOSM组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步检查发现：IL-4和IFN-γ在不同组小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清中的表达量也有不同程度的改变：模型组IL-4与DAPT组和对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，而与DMSO组相近(P>0.05)。DAPT组小鼠IL-4表达量较DMSO组下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而与对照组相近(P>0.05)。同时DAPT组IFN-γ的含量却增加，与模型组及DMSO组差异均有统计学意义(P<0.05),与对照组相比P>0.05。

本实验结果表明γ-分泌酶抑制剂DAPT可以改善过敏性鼻炎小鼠的过敏症状、减轻鼻黏膜病理改变及影响其血清抗体IgE的浓度；进一步通过调节Th1/Th2细胞平衡，抑制Th2型细胞因子分泌并促进Th1型细胞因子分泌，促使Th0细胞向Th1方向分化，从而参与过敏性鼻炎的发生发展。研究结果和Kang等[11]针对哮喘的研究结果相一致，再次验证了AR与过敏性哮喘的“同一气道，同一疾病”这一学说。但本研究对过敏性鼻炎小鼠鼻黏膜和外周血Notch信号通路的活化情况未进行研究，实验中γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后模型小鼠过敏症状的减轻、血液抗体浓度改变及小鼠鼻腔黏膜病理学改变是否与Notch信号基因表达发生变化有关，需要进一步验证。同时由于本实验建模样本量少，用于实验的DAPT选择了有效范围内其中一个较低浓度，可能是导致实验结果(相关细胞因子的检测浓度偏低，而IgE的检测浓度偏高)与临床研究不一致的原因，尚需进一步实验验证。