人核仁磷酸化蛋白1(NOLC1)影响禽流感病毒感染过程研究进展

朱春玉， 赵 莹， 易文富， 刘宏生， 郑方亮

(辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

禽流感疫情被称为“鸡瘟”，首次发现于1878年，该疫情导致意大利家鸡大量死亡。此后，“鸡瘟”在全世界的影响范围逐渐扩大，直到1955年，Schafer发现并证实“鸡瘟”的罪魁祸首是A型流感病毒，因其感染禽类而被称为禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)。AIV感染能够引起禽类从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状，通常会引起家禽大批量死亡，给家禽养殖业带来毁灭性打击，自1997年首次报道禽流感感染人致死病例以来，全球爆发了多次禽流感感染人致死的疫情，给人类健康造成严重威胁，因此该病毒是一种人畜共患病毒[1-2]。AIV属于正黏病毒科，基因组由8条RNA构成，根据病毒表面神经氨酸酶和血凝素的不同分为众多亚型[3]。目前已经确认有7种病毒亚型能够感染人类，多为H5和H7亚型的高致病性禽流感病毒。禽流感病毒通过表面血凝素(HA)与宿主细胞表面受体的特异性识别结合进入细胞，在宿主细胞内复制后最终以出芽的方式释放。在复制过程中，由其自身编码的非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)通过与宿主细胞多种蛋白的相互作用从而调节病毒的复制。其中人核仁磷酸化蛋白(nucleolar and coiledbody phosphoprotein 1，NOLC1)，又名hNopp140或Nopp140，是近年来发现的一种NS1的相互作用蛋白，该蛋白参与核仁组装、细胞发育和肿瘤发生等过程，同时在禽流感病毒感染过程中也发挥了重要作用[4]。

1 NOLC1蛋白的结构

NOLC1蛋白是一种核定位信号结合蛋白，大小为140 kDa，最早在大鼠肝细胞核中发现并鉴定。NOLC1蛋白能在细胞核和细胞质中穿梭[5]，在细胞间期NOLC1蛋白以颗粒状形态存在于核仁之中，当细胞进入有丝分裂时期时，NOLC1蛋白的颗粒状形态便不复存在，被均匀分配到两个细胞的细胞质中，随后与RNA聚合酶Ⅰ发生相互作用表达rRNA基因，参与核仁发生的过程[6]。NOLC1蛋白结构特殊，它不具有RNA结合域和富含谷氨酸/精氨酸的链段，而是包含保守的N-末端、C-末端以及一个由多个重复的酸性和碱性氨基酸构成的中心结构域。中心结构域由带正电和带负电的氨基酸交替组成，最可能的理由是为蛋白之间发生相互作用提供作用位点[7]。NOLC1蛋白具有多个磷酸化位点，是细胞内磷酸化程度最高的蛋白之一[6]。迄今为止，已经发现的可以使NOLC1蛋白磷酸化的蛋白激酶有酪蛋白激酶2(CK2)、细胞周期依赖性激酶2(cdc2激酶)和蛋白激酶A(PKA)[8]。NOLC1蛋白由于含有82个酪蛋白激酶CK2靶序列，因此主要依赖于CK2的磷酸化发挥作用[9]。同时，NOLC1蛋白还可与CK2结合，作为CK2的高度磷酸化蛋白抑制剂抑制该酶的催化活性[10]。

2 NOLC1蛋白的功能

现有研究证明，NOLC1蛋白能够与多种核仁蛋白及核仁生物合成相关蛋白相互作用。NOLC1蛋白含有一段名为Nopp140.24的核定位信号序列，能够保证其在细胞核和细胞质中穿梭[6]。NOLC1蛋白能够同RNA聚合酶Ⅰ相互作用调节rRNA的合成，参与核仁裂解、组装和维持完整的过程[11]。NOLC1蛋白能够与核仁小核糖蛋白体颗粒(snoRNP)发生相互作用，帮助snoRNP在Cajal小体(Cajal body,CB)内组装成熟后穿过不同的核间隔并转运到核仁中发挥作用[12]。He等[13]研究发现果蝇的Nopp140基因缺失会诱导亚细胞核糖体发生病变。Lee等[14]证实了新杆状线虫的一种核仁蛋白DAO-5基因是Nopp140基因家族的成员之一，DAO-5基因对早期胚胎细胞的细胞核的生物合成具有重要作用，DAO-5基因会导致cep-1基因发生反式激活进而降低rDNA的转录速率，诱导核糖体发生病变，生殖细胞系发生凋亡。

NOLC1蛋白还参与炎症发生、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生等相关信号通路的调控。Hwang 等[15]研究发现干扰NOLC1可以抑制鼻咽癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，其机制为NOLC1蛋白通过与TP53区的启动子结合并与TP53的协同作用来调节MDM2表达，从而参与鼻咽癌的调节，这表明NOLC1蛋白在肿瘤的发生发展过程中起致癌基因的作用。NOLC1蛋白在肝癌细胞的生存发展中同样具有十分关键的作用。与非癌细胞相比，NOLC1在肝肿瘤组织中被沉默或下调[4]。转录因子NF-κB和CREB能够通过与NOLC1的最小启动子结合对NOLC1蛋白的表达进行调控，通过对NOLC1启动子的激活作用上调NOLC1的表达[11]。研究发现抑制NF-κB活化会导致转化的肝细胞凋亡，从而无法发展成肝细胞癌[16]；CREB也被证实通过调节肿瘤生长、血管生成和细胞凋亡的过程在肝细胞癌进程中发挥重要作用[17]，以上可能是NOLC1调节肝癌细胞发生的作用机制。NOLC1蛋白在肺癌肿瘤发生的调节中也发挥作用，但具体作用机制仍未明了，肺癌肿瘤的抑制可能与受到p53上调导致的NOLC1下调有关[18-19]。

研究发现过表达和敲降NOLC1都会导致肺癌细胞凋亡增加，但过表达NOLC1会更加促进肺癌细胞凋亡。过表达NOLC1对肺癌细胞的促凋亡率明显高于正常细胞，其可能通过线粒体介导的细胞凋亡途径、TNF-α介导的细胞凋亡途径以及cyclin Y介导的细胞凋亡途径共同诱导肺癌细胞发生凋亡。实验通过检测线粒体膜电位发现过表达NOLC1使肺癌细胞膜电位下降，增加了肺癌细胞早期细胞凋亡的比例。进一步的qRT-PCR显示促凋亡基因如TNF-α、BAX和CASP8均上调，这表明NOLC1的过表达能使NF-κB转录活性增强和TNF-α表达增加，这将导致细胞凋亡的发生。Western blot显示caspase-8表达的上调和cyclin Y表达的下调，这表示NOLC1的过表达导致的细胞凋亡与cyclin Y介导的细胞凋亡途径有关，但具体机制仍未明确，需要进一步的研究探索(结果待发表)。

3 NS1蛋白与NOLC1蛋白的相互作用

NS1蛋白是A型流感病毒唯一的非结构蛋白，NS1蛋白在不同亚型的禽流感病毒中均有表达，高度保守。NS1具有多种功能，如抑制宿主自身细胞蛋白的合成、调节流感病毒的致病力的大小、调控宿主细胞产生干扰素等，还具有促进和抑制凋亡的双重作用[20-21]。宿主细胞被禽流感病毒侵染后，病毒的NS1与宿主细胞中的蛋白发生相互作用，通过调节宿主蛋白的分布、增强病毒蛋白的表达以及调节细胞周期等方式影响病毒的复制进程。

Zhu等通过T7噬菌体展示方法筛选发现NS1蛋白与NOLC1蛋白间存在特异性相互作用[22]，该作用也得到了免疫共沉淀、pull down等实验的证实[23]。进一步研究表明NOLC1和NS1蛋白同时表达于细胞核内，这为二者的相互作用奠定了空间基础。Zhu等通过截短体及点突变等方式进一步确定了NS1蛋白与NOLC1蛋白相互作用发生在NS1效应结构域的第104～200位氨基酸区域[23]，并证实NS1蛋白第120位D和第195位R是参与NS1与NOLC1蛋白相互作用的关键氨基酸位点[24]。氨基酸序列比对表明第120位D和第195位R在A型流感病毒不同亚型NS1蛋白中具有高度保守性，由此可见NS1-NOLC1相互作用在所有A型流感病毒中具有普遍性。

4 NOLC1蛋白对流感病毒感染过程的影响

流感病毒的感染过程包括病毒侵入、病毒复制和宿主细胞对病毒的免疫反应等几方面。NS1蛋白在病毒复制及应对宿主细胞免疫反应过程中发挥着重要作用，鉴于NS1蛋白和NOLC1蛋白存在相互作用，而且NOLC1蛋白在细胞周期调控、细胞凋亡和炎症反应中扮演重要角色，两者的相互作用必然影响病毒的复制进程。

4.1 NOLC1蛋白在流感病毒侵入后对宿主细胞的影响

研究表明NOLC1蛋白与NS1相互作用后会促进流感病毒敏感细胞A549细胞的凋亡，NS1蛋白与NOLC1蛋白作用强度越大，引起宿主细胞凋亡程度越高。研究表明，这与CK2存在一定的关系，CK2能够通过磷酸化一系列细胞凋亡相关因子发挥其抗凋亡的作用，影响细胞的生长发育，抑制或过表达CK2都会影响细胞的生长周期及凋亡情况，因此CK2被认为是细胞凋亡的抑制剂之一，与多种癌症相关。NOLC1含有多个CK2特异的磷酸化位点，CK2对NOLC1广泛磷酸化后，磷酸化的NOLC1又可以与CK2发生相互作用从而抑制CK2活性[25]。进一步实验发现NS1与NOLC1相互作用还会抑制CK2的表达，因此可以推断NS1与NOLC1相互作用在降低CK2表达量的同时还抑制了其活性，从而促进了细胞凋亡。

4.2 NOLC1蛋白对流感病毒复制的影响

禽流感病毒的感染开始于病毒表面HA与细胞表面唾液酸α-2,3或α-2,6受体糖蛋白的结合，通过内吞作用使病毒进入受体细胞[26]。在内体小泡内，病毒粒子HA蛋白被蛋白酶水解，构象发生改变使得位于HA N端的融合肽暴露，促使病毒囊膜与内体小泡进行膜融合，病毒的核糖核蛋白体(vRNP)复合物从病毒内释放进入细胞质，然后转运至细胞核。vRNP在细胞核内进行病毒基因的转录和复制[27-28]。病毒基因的转录和复制需要依赖病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，Rdrp是由PA、PB1和PB2蛋白质组成的三聚体复合物，RdRp与核蛋白NP一起构成病毒转录复制的最小单位。病毒RNA转录出互补的正义RNA链并以此为模板复制出更多的病毒RNA作为子代病毒的基因组[29-30]。同时病毒转录出mRNA，并进入细胞质翻译，所翻译出的PA、PB1、PB2和NP等蛋白重新进入细胞核，与病毒子代RNA结合形成子代vRNPs，随后vRNP将会在核输出蛋白(NEP)和基质蛋白1(M1)的协助下转运进入细胞质中进行包装。所表达的病毒胞膜蛋白NA、HA和M2在高尔基体内修饰后嵌入细胞膜内，M1协助vRNP和成熟的胞膜蛋白组成子代病毒颗粒并出芽，最后，由NA蛋白切割宿主细胞膜与病毒囊膜之间连接的唾液酸受体糖蛋白，将吸附在宿主细胞膜上的子代病毒粒子释放出来[31]。

研究发现，NS1与NOLC1相互作用能够影响病毒的复制。通过进行NOLC1的敲降和过表达发现，过表达NOLC1能够促进病毒的复制，而敲降NOLC1稳转株则抑制流感病毒的复制，这表示病毒的复制水平与宿主内NOLC1的表达量存在正相关的关系。由此可以推测，病毒进入细胞后，NS1通过与NOLC1结合影响了NOLC1的正常功能，从而降低了细胞内病毒的复制水平。进一步研究表明，在禽流感病毒感染宿主细胞后的48 h内，NOLC1 mRNA的表达量整体呈下降趋势。这说明病毒不但通过NS1的结合抑制了NOLC1，而且还通过其他方式降低NOLC1的表达量从而进一步影响了NOLC1的功能(结果待发表)。鉴于NOLC1具有调节细胞周期的功能，可以推断NS1与NOLC1的结合干扰了NOLC1的正常功能，促进了细胞的凋亡，从而影响了病毒的复制。另一方面，NOLC1具有调节炎症反应的功能，NS1与NOLC1相互作用可能会影响宿主细胞内某些抗病毒反应细胞因子的表达或某些与炎症发生相关的信号通路，从而影响宿主细胞的天然免疫反应，影响病毒复制。这些问题的具体机制还有待进一步研究阐明。

5 展 望

禽流感是一种四季均可发病且具有严重预后的传染病之一，因此防控其发生及疾病治疗十分重要。禽流感病毒自身表达的非结构蛋白1(NS1)作为影响病毒复制的重要蛋白，是唯一不包装到病毒颗粒的蛋白，并大量产生于感染细胞中，其能够与宿主细胞内如NOLC1蛋白等多种蛋白发生相互作用，是决定病毒感染能力的重要因素。人核仁磷酸化蛋白NOLC1，是一个高度磷酸化的哺乳动物蛋白，在细胞中与RNA聚合酶I相互结合，参与核仁的发生，调节rDNA(核糖体DNA)的转录，同时也参与到炎症发生、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生等相关信号通路的调控，对细胞生命周期在时间上的长短调控起到了十分重要的作用，这些细胞活动均与病毒感染有着密不可分的联系，因此对非结构蛋白1(NS1)和NOLC1的研究在甲型禽流感病毒的致病机理、传播及治疗等众多领域都具有深远而重大的意义。

我们依据现有的研究证明NS1与NOLC1的相互作用能够影响宿主细胞凋亡和病毒的复制，这只能在现象上说明NOLC1会影响流感病毒感染宿主细胞的进程，但更为精细的分子机制还需要深入研究。为了进一步明确NOLC1蛋白在禽流感病毒感染过程中的作用，我们在本实验室前期研究成果基础上拟通过反向遗传学技术(即感染性克隆)拯救出NS1基因定点突变的甲型禽流感病毒，通过比较野生型病毒和突变病毒，在活病毒水平探究NS1与NOLC1的相互作用对病毒复制增殖、宿主细胞活性及细胞周期的影响。明确NOLC1蛋白在流感病毒感染过程中的作用及方式，将进一步揭示流感病毒感染宿主细胞的分子机制，并为新的抗流感病毒药物的研发提供新的靶点和方向。

另一方面，由于NOLC1蛋白是人体细胞信号通路调控的一类非常重要的蛋白，病毒感染后NOLC1和NS1两蛋白的相互作用必然对诸多细胞活动造成影响，比如对炎症反应的信号通路的影响，与NS1作用后能否继续与IP6共同对蛋白激酶CK2有调控作用，以及感染后NOLC1对端粒重复结合因子(TRF2)的调节等等。目前，NOLC1蛋白的分子功能研究报道较少，因此其对流感病毒感染影响的机制还有很多可深入研究的内容，探明NOLC1对这些信号调控的具体分子机制不但具有一定的理论意义，而且能够为新的抗病毒药物的设计提供依据，具有十分重要的应用价值。