LncRNA FTX 对慢性髓细胞性白血病细胞伊马替尼抵抗的影响及机制研究△

王瑾，马肖容，刘海玲，姚欢，张卉

西安交通大学第二附属医院血液内科，西安 710000

慢性髓细胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是慢性白血病中最常见的一种类型，患者早期多无临床症状，常因白细胞增多或慢性脾脏肿大而就诊。随着临床诊疗技术的发展，骨髓移植和靶向治疗药物在CML的治疗中起重要作用。伊马替尼（Imatinib）作为第一代靶向Bcr-Abl融合基因的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI），其有效性和安全性均已被证实。然而，伊马替尼耐药是CML治疗的一个主要问题，严重影响了CML患者的临床疗效[1]。因此，明确伊马替尼耐药的形成机制对于指导TKI临床合理应用具有重要意义。随着基因技术的发展，下调微小RNA（microRNA，miRNA）-451能够有效改善CML细胞对伊马替尼的耐药性，但其具体机制仍未完全阐明[2]。目前，长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）被广泛研究，其能够影响编码蛋白基因的上游启动子区转录、抑制RNA聚合酶的活性、干扰mRNA的剪切等，从而发挥作用。LncRNA FTX属于LncRNA，与肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的进展及耐药性的产生密切相关[3-5]。因此，本研究对LncRNA FTX与人CML细胞伊马替尼抵抗的关系及可能的作用机制进行初步分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

人CML细胞（K562）、人胚胎肾细胞（293T）均购自美国菌种保藏中心，RPMI 1640、DMEM/F12培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司，1%青霉素-链霉素溶液购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶、阳离子聚合物均购自美国Sigma-Aldrich公司，转染脂质体 Lipofectamine™RNAiMAX Reagent、Nanodrop 2000c分光光度计均购自美国Thermo Scientific公司，慢病毒包装质粒载体pLP-VSVG购自美国Addgene质粒保藏中心，RNA提取试剂RNAiso Reagent、SYBR Green核酸荧光染料和Trizol试剂均购自日本Takara公司，无酶水购自美国Invitrongen公司，多聚嘧啶序列结合蛋白1（polypyrimidine tract-binding protein 1，PTBP1）一抗购自美国Abacm公司，逆转录试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购自上海Roche公司。DM500光学显微镜购自德国徕卡相机股份有限公司，酶标仪购自美国Molecular Devices公司，凝胶成像仪、逆转录PCR仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将K562和293T细胞接种于75 cm2培养瓶中，采用RPMI 1640或DMEM/F12培养基＋10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。传代时贴壁细胞使用胰蛋白酶消化，加入含血清的培养基终止消化，按照1∶3的比例对细胞进行传代和培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组 应用间歇浓度梯度递增法诱导K562细胞对伊马替尼产生耐药，采用0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L的伊马替尼对K562细胞进行分步诱导。在每个浓度梯度下维持培养细胞2周以上，待细胞生长状态良好后，均在伊马替尼浓度为4 μmol/L的培养基中筛选，直至细胞可维持生长，继续培养1周后完成伊马替尼抵抗组细胞的构建，采用等体积生理盐水处理CML细胞作为伊马替尼敏感组。

通过10μlLipofectamine™ RNAiMAX 转 染pLP3-VSVG（每孔 0.45 μg）和 LncRNA FTX（每孔1.5 μg）于293T细胞中，48 h后收集病毒悬液，0.22 μm过滤器过滤悬液，扩增质粒用于后续使用。将收获的慢病毒感染抵抗组细胞接种于6孔板，采用DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1 ml病毒悬液培养，同时加入3 μl聚凝胺，连续感染2天，氨苄霉素筛选，细胞生长状态良好。抵抗组细胞转染LncRNA FTX siRNA慢病毒作为转染组，构建伊马替尼抵抗的LncRNA FTX细胞系，并将转染空白载体的抵抗组细胞作为对照组。

1.2.3 CCK-8法检测伊马替尼的IC50值 接种处于对数生长期待测的4组细胞，应用细胞计数仪进行计数，以5000/孔细胞接种至96孔板，培养24 h后，待细胞贴壁完成后，弃上清，加入不同终浓度（0、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的伊马替尼稀释溶液，处理48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃、5%CO2孵箱中孵育2 h，采用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值。按照吸光度值绘制细胞生存曲线，计算细胞的半抑制浓度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）和耐药指数。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中PTBP1蛋白的相对表达量 将RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂PMSF混合后冰上裂解，离心提取，按照1∶5的比例加入上样缓冲液煮沸。参考目的蛋白配制浓缩胶和分离胶，按照实验设计，依次上样，开始电泳。选取20 μl目的蛋白先进行β-actin抗体的电泳（一抗稀释浓度为1∶400）。再进行PTBP1抗体的孵育，湿转至聚偏二氟乙烯膜，TBSTw封闭液封闭1 h，一抗4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜，发光液曝光显影，抗体稀释浓度依据说明书而定。分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算PTBP1蛋白的相对表达量。

1.2.5 逆转录PCR检测细胞中LncRNA FTX和PTBP1mRNA 的相对表达量 采用逆转录PCR检测4组细胞中LncRNA FTX的表达及转染组和对照组细胞中PTBP1mRNA的表达水平。采用Trizol提取各组细胞中的总RNA，提取并检测RNA纯度。参考逆转录试剂盒说明书将提取后的RNA进行逆转录，得到cDNA产物。根据PCR试剂盒说明书进行PCR反应，以β-actin作为内参，并进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中LncRNA FTX相对表达量的比较

抵抗组细胞中LncRNA FTX的相对表达量为（0.17±0.01），明显高于敏感组的（0.03±0.01），差异有统计学意义（t=9.746，P＜0.01）。转染组细胞中LncRNA FTX的相对表达量为（0.03±0.01），明显低于对照组的（0.18±0.01），差异有统计学意义（t=5.318，P＜0.01）。

2.2 各组细胞伊马替尼IC50值的比较

CCK-8法检测结果显示，伊马替尼对敏感组、抵抗组、对照组和转染组细胞的IC50值分别为（1.410±0.096）、（7.060±0.635）、（7.282±0.839）和（3.704±0.285）μmol/L。伊马替尼对抵抗组细胞的IC50值明显高于敏感组，差异有统计学意义（t=15.657，P＜0.01）；伊马替尼对转染组细胞的IC50值明显低于对照组，差异有统计学意义（t=10.546，P＜0.01）。

2.3 敏感组与抵抗组细胞中PTBP1蛋白相对表达量的比较

Western blot检测结果显示，抵抗组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量为（1.02±0.05），明显高于敏感组的（0.52±0.01），差异有统计学意义（t=6.547，P＜0.01）。（图1）

图1 Western blot 检测敏感组和抵抗组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量

2.4 转染组与对照组细胞中PTBP1蛋白与mRNA相对表达量的比较

Western blot检测结果显示，转染组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量为（0.59±0.02），明显低于对照组细胞的（1.37±0.06），差异有统计学意义（t=1.855，P＜0.01）（图2）。逆转录PCR结果显示，转染组和对照组细胞中PTBP1mRNA的相对表达量分别为（2.09±0.22）和（1.96±0.18），组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 Western blot 检测转染组与对照组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量

3 讨论

CML主要见于中老年人群，发病隐匿，早期临床症状不明显，易被忽略，病情进展后可出现巨脾、白细胞增多，导致患者生活质量较差，最终因病情急变而死亡[6]。自TKI药物问世以来，靶向治疗因其高效、安全的特点已逐渐成为CML的一线治疗方案。但在应用TKI治疗的过程中，部分CML患者会逐渐出现对靶向药物耐药的现象，从而影响其远期疗效。目前，关于CML细胞耐药的具体分子机制尚未完全明确，因此，对其进行研究对CML的治疗具有重要意义[7]。

Long等[8]研究发现，LncRNA FTX能够靶向miRNA-29b-1-5p和Bcl2l2从而调控心肌细胞的凋亡。Yang等[9]研究发现，LncRNA FTX可通过抑制miRNA-215的磷酸化从而促进结直肠癌的进展。Li等[10]研究发现，LncRNA FTX通过促进有氧糖酵解和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表达从而促进肝细胞癌的恶化。此外，LncRNA FTX在脑胶质瘤中的表达水平较高，并且能够负反馈调节miRNA-342-3p的表达，促进脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭。同时，有研究发现，敲低LncRNA FTX能够抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且LncRNA FTX的表达情况对急性髓系白血病的耐药性具有较大影响[12-13]；上述研究均表明LncRNA FTX与肿瘤的自身特性及其对药物的耐药性密切相关。PTBP1属于异质性核糖核蛋白家族中的一员，在RNA稳定性、选择性剪切和蛋白降解等方面均发挥作用[14-15]。有研究显示，下调PTBP1的表达能够有效调节耐药性结肠癌细胞的糖酵解过程，减少其对长春新碱的耐药性[16]。Li等[17]研究发现，miRNA-124/PTBP1/PKM2轴能够通过Linc-ROR调控胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。上述研究表明，PTBP1与LncRNA FTX均能够明显调控肿瘤细胞对药物的耐药性，且LncRNA FTX与PTBP1可能存在相互作用，推测LncRNA FTX可通过调节PTBP1的表达从而改变CML细胞对药物的耐药性。然而，目前关于PTBP1与CML关系的研究较少，且PTBP1与LncRNA FTX关系的研究尚未见。

本研究检测了敏感组和抵抗组细胞中LncRNA FTX的表达情况，结果发现，LncRNA FTX和PTBP1蛋白在抵抗组细胞中的表达均明显上调，提示LncRNA FTX和PTBP1蛋白可能均与CML细胞对伊马替尼的抵抗有关，与Shinohara等[18]的研究结果一致。本研究将LncRNA FTX siRNA载体转染至抵抗组细胞，外源性下调抵抗组细胞中LncRNA FTX的表达，结果发现，伊马替尼对转染组细胞的IC50值明显降低，转染组PTBP1蛋白的表达明显下调，而转染组和对照组细胞中PTBP1mRNA的表达差异不大，提示LncRNA FTX可能通过下调PTBP1蛋白的表达从而降低其稳定性或活性，进一步影响CML细胞对伊马替尼的敏感性。

综上所述，LncRNA FTX可能通过调节PTBP1蛋白的表达逆转人CML细胞对伊马替尼的耐药性。后续研究将进一步探讨LncRNA FTX与PTBP1蛋白相互作用的具体方式，为临床伊马替尼耐药性的逆转、靶向药物的设计以及多种药物联合化疗的应用提供一个新的思路。