基底刚度对人宫颈癌HeLa 细胞增殖及顺铂药物敏感性影响的体外研究△

焦思萌，赵轩宇，宋丹，陈娇，商若天，张强，刘思迪，孔为民#，韩东

首都医科大学附属北京妇产医院1产一科，2妇瘤科，北京 100006

3国家纳米科学中心，北京100190

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率位居首位[1]。中国每年新发病例约13.15万例，每年死于宫颈癌的患者约5万例[2]。在中晚期宫颈癌的治疗中顺铂是单药化疗最有效的药物[3]，但因患者的个体差异和化疗耐药的问题，宫颈癌患者化疗疗效存在很大差异。目前有关宫颈癌化疗敏感性及化疗耐药的相关研究多集中于宫颈癌细胞内在因素的影响，如相关基因、蛋白的表达，相关信号转导通路等。宫颈癌细胞并不是孤立生长的，其所生存的细胞微环境可能在其发生、发展的过程中发挥着重要作用[4]。肿瘤微环境中的参数包括刚度、形貌、曲率及剪应力等。基底刚度是肿瘤微环境中的一个重要的力学参数，刚度是指细胞或组织在载荷作用下抵抗弹性形变的能力。本研究从细胞微环境中的力学因素出发，探讨改变基底刚度是否会影响宫颈癌细胞的生长情况，是否影响顺铂对宫颈癌细胞的细胞毒作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源及实验试剂 人宫颈癌HeLa细胞株购自美国模式培养物集存库；顺铂粉剂购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.1.2 不同基底刚度培养皿的选择 水凝胶培养基模拟不同组织的刚度。选择0.5、5、25kPa分别模拟淋巴结、肺组织及宫颈脱落细胞的刚度；并以普通塑料培养皿作为对照，其刚度约为106kPa[5]。可控刚度的水凝胶培养皿购自北京德润丰科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HeLa 细胞的培养 将HeLa细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖活性检测 取对数生长期的HeLa细胞，以每孔2×l04个细胞分别接种于基底刚度为0.5、5、25 kPa水凝胶培养皿及普通塑料24孔板（106kPa）中培养。分别于接种后第4～96小时，按照CCK-8试剂盒说明书操作，在450 nm波长处测定细胞活性。每个刚度每个时间点条件下设立5个平行孔，实验共重复3次。

1.2.3 顺铂药敏实验 在不同基底刚度分组的基础上，按照不同给药浓度分为顺铂加药组，同时设立阴性对照组（含细胞和培养基，不加药物，即药物浓度为0 μmol/L）及空白对照组（不含细胞只含培养基），每组设立3个复孔，实验重复3次。顺铂药物浓度梯度根据药物血峰值浓度（peak plasma concentration，PPC）设计，顺铂药物PPC为12.6 μmol/L[6]，故设顺铂药物浓度梯度为0、5、10、20、40 μmol/L。取对数生长期的HeLa细胞，以每孔2×l04个细胞的密度分别接种于基底刚度为0.5、5、25 kPa水凝胶培养皿及普通塑料24孔板（106kPa）中，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h后，顺铂加药组每孔加入不同浓度的顺铂，终浓度分别为0、5、10、20、40 μmol/L，共同培养24 h后采用CCK-8法行细胞毒性试验。计算细胞存活率，存活率=（[顺铂加药组平均吸光度值（optical density，OD）-空白对照组平均OD值）（/阴性对照组平均OD值-空白对照组平均OD值）]×100%，计算不同浓度顺铂作用下HeLa细胞的存活率，并制作细胞毒性曲线，计算出半数抑制浓度（IC50）值。计算IC50公式：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，Xm 为lg 最大剂量，I为 lg最大剂量/相邻剂量，P为阳性反应率之和，Pm为最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率[7]。

1.3 统计学方法

HeLa细胞增殖活性实验及其顺铂药物敏感性实验中所得数据应用Graphpad Prism软件绘制细胞存活曲线。

2 结果

2.1 基底刚度对HeLa宫颈癌细胞增殖活性的影响

将相同数量的HeLa细胞接种于不同基底刚度的24孔板中，从接种当天第4小时开始，连续4天（96 h）应用CCK8法测定细胞密度。并根据4～96 h每组细胞的OD值绘制增殖曲线。培养后24、48、72、96 h，随基底刚度的增加OD值（细胞增殖活性）呈上升趋势。（图1）

图1 不同基底刚度培养皿中HeLa 细胞增殖曲线

2.2 基底刚度对HeLa 宫颈癌细胞顺铂药物毒性的影响

在同一基底刚度下，HeLa细胞存活率随顺铂浓度增加而降低。而在相同顺铂浓度下，随基底刚度的增加HeLa细胞存活率呈下降趋势（图2）。根据公式计算出各组IC50值，0.5、5、25 kPa水凝胶培养皿及普通塑料培养皿中HeLa细胞顺铂IC50值分别为137.20、97.62、52.87、18.40 μmol/L。

图2 不同基底刚度下不同浓度顺铂处理后HeLa细胞的存活率

3 讨论

宫颈癌是世界范围内第二大常见女性恶性肿瘤，在女性与肿瘤相关的死因中，宫颈癌位居第2位。为了提高患者的生存率，妇科肿瘤医师不断摸索不同的综合治疗模式，1983年首次报道宫颈癌是化疗敏感的肿瘤，目前应用最广泛的药物有顺铂或卡铂、紫杉醇、异环磷酰胺和博来霉素等。对于中晚期及复发性宫颈癌患者，顺铂仍是最有效的姑息性化疗药物[8]。但因患者的个体差异和化疗耐药的问题，宫颈癌患者在同步放化疗后的疗效存在很大差异，30%～40%的患者在接受标准治疗后的两年内发生了局部复发或远处转移[9]。因此，关于中晚期宫颈癌同步放化疗如何提高化疗敏感性的问题需要进一步系统的研究。

肿瘤微环境中纳米力学相关的参数包括刚度、形貌、曲率以及剪应力等，它们对细胞的行为有重要的影响。其中基底刚度是肿瘤微环境中一个重要的力学参数，刚度是指细胞或组织在载荷作用下抵抗弹性变形的能力。基底刚度作为肿瘤微环境中一个很重要的生物力因素，参与细胞的生长、活性、分化和迁移等生物学过程[5-6,10]。细胞为适应其周围微环境力学性质的改变，其自身黏附能力、迁移能力以及骨架状态等都会发生相应变化，从而使自身的力学性质也发生改变[11-12]。此前，有关基底刚度对宫颈癌的相关研究较少，故设计了本实验研究。

3.1 基底刚度对宫颈癌HeLa细胞增殖活性的影响

有研究显示，基底的力学性能可影响细胞的增殖活性，但并非所有细胞均对基底刚度的改变产生响应[13]。多数细胞倾向于在刚度较大的基底上铺展面积更大、黏附更好、增殖活性更强；而在较低刚度的基底上铺展、黏附及增殖情况均较差，甚至不能存活[14]。实验发现，少数细胞如神经元细胞，在基底刚度较小的培养材料上生长情况更好；另有如中性粒细胞等，其生长状态及增殖情况受基底刚度改变影响不大，其在3～50 kPa刚度范围的基底上均能存活[15]。本实验的研究结果显示，随基底刚度的增大，人宫颈癌HeLa细胞的增殖活性更强。

3.2 基底刚度对宫颈癌HeLa 细胞顺铂药物毒性的影响

基于前述基底刚度对HeLa细胞增殖的研究，进一步探讨了在不同基底刚度培养皿中HeLa细胞对顺铂药物敏感性的差异。本实验结果显示，在相同顺铂浓度下，HeLa细胞存活率随基底刚度的增加呈下降趋势，即增加基底刚度可提高HeLa细胞对顺铂的敏感性。Feng等[16]有关乳腺癌MCF细胞的体外研究显示，在刚度较大的基底上乳腺癌MCF细胞对化疗药物顺铂及紫杉醇的药物毒性反应均有不同程度的增加。Schrader等[17]在基底刚度对肝癌细胞化疗敏感性的研究中亦发现，与较小的基底刚度相比，在刚度较大的基底上肝癌细胞对化疗药物的毒性反应更明显。另有相关研究显示，与较小刚度的水凝胶相比，在刚度较大的玻璃基底上，顺铂对肺成纤维细胞的效果更明显[18]。Liu等[19]研究结果显示，基底刚度的改变亦可影响乳腺癌SK-BR-3细胞对靶向药物拉帕替尼药物毒性的响应，即在刚度较大的基底上SK-BR-3细胞对拉帕替尼的药效更明显。以上研究结果均提示，肿瘤微环境中力学因素——刚度的改变可能引起肿瘤细胞对药物反应的差异。

2002年首次提出了“生物力药理学”的概念[20]。生物力药理学主要考虑药物与体内生物力学因素的联合作用：一方面药物具有药效，同时也可能调整体内的生物力学环境；另一方面，生物力学因素可能具有生物学功效，也可能影响药物代谢与药效。生物力药理学是研究药理学因素（药物）对体内生物力学因素的干预，也研究生物力学因素对药效与药物代谢的影响，以及药物与力学因素的联合生物学效应。以往的相关研究以及本研究结果均显示了基底刚度影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应，这提示肿瘤的药物治疗中需考虑生物力学因素与药效、药理的密切关系。基于上述基底刚度可影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物反应的观点，在体外药物实验过程中也应该考虑到刚度这一关键的生物力学因素，以达到更好的药物实验效果。本研究结果也证明了生物力药理学的合理性。

通过本研究发现基底刚度的改变不但影响着宫颈癌细胞HeLa的生长，也影响着其对化疗药物的敏感性。因此在宫颈癌的临床治疗中，应考虑到基底刚度改变对肿瘤生长与治疗的影响。今后将进一步研究基底刚度改变对HeLa细胞生长、化疗敏感性影响的分子生物学机制，如寻找刚度相关基因、力学相关分子靶点、刚度相关信号通路等；并寻找能够改变肿瘤细胞外力学环境的有效方法，如应用药物、基因治疗等，进而从微环境中的力学因素角度出发，寻找提高宫颈癌化疗敏感性的有效方法，提高宫颈癌的临床治疗效果。