VASH1和VASH2表达对食管鳞状细胞癌患者预后的影响

程诚，郑瑞峰，王彦威

武警河南省总队医院肿瘤内科，郑州 450000

食管癌是中国常见的恶性肿瘤，与其他胃肠道肿瘤相比，食管癌的恶性程度较高，预后相对较差[1]。肿瘤新血管生成对肿瘤的生长、进展和远处转移均至关重要。因此，肿瘤新血管生成被认为是衡量肿瘤恶性程度的重要指标[2]。有研究显示，肿瘤血管生成与食管癌的恶性程度呈正相关[3]。血管抑制蛋白（vasohibin，VASH）家族是一种新的血管生成负反馈调节因子，参与肿瘤的多种病理生理过程，主要由VASH1及其同系物VASH2两个亚型组成，在血管生成的调节中具有重要作用，VASH1主要表达于血管内皮细胞，通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）等血管生成刺激因子诱导血管生成[4-5]。VASH2主要表达于肿瘤细胞和CD11b阳性单核细胞浸润新生血管活跃的区域，有研究发现，VASH1、VASH2是与肿瘤血管生成、恶性肿瘤发生有关的预后因子[6-7]，但关于其在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中作用的研究较少见。此外，关于ESCC组织中VASH1和VASH2表达的相关性及其与患者预后关系的研究较少见。本研究探讨VASH1、VASH2表达与ESCC患者预后的关系，以期为ESCC患者预后的预测提供新的思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年5月至2017年4月于武警河南省总队医院行根治性手术的ESCC患者。纳入标准：符合《中国早期食管鳞状细胞癌及癌前病变筛查与诊治共识（2015年·北京）》[8]中的相关诊断标准，并经病理学检查证实为ESCC；患者意识清晰，无听力、认知及沟通障碍。排除标准：合并严重精神疾病；临床资料不全；肿瘤已发生侵袭和转移。根据纳入和排除标准，本研究共纳入209例ESCC患者，其年龄为42～69岁，平均年龄为（64.81±2.09）岁；男172例，女37例；肿瘤部位：上段21例，中段118例，下段70例；肿瘤直径为23～64 mm，平均肿瘤直径为（49.41±5.08）mm；分化程度：高分化65例，中分化100例，低分化44例；淋巴管侵犯：阴性45例，阳性164例；静脉侵犯：阴性65例，阳性144例；浸润性生长：a17例，b162例，c30例；pT分期：T1期85例，T2期37例，T3期87例；pN分期：N0期70例，N1期63例，N2期62例，N3期9例，N4期5例；淋巴结转移枚数：2.71±0.62；pTNM分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期76例，Ⅲ期82例，Ⅳ期5例；未接受过辅助化疗者95例，接受过辅助化疗者114例。所有患者均由同一组具备5年以上临床经验的医师采用相同的手术方式进行治疗，术后均行常规辅助治疗。

1.2 免疫组织化学染色方法

手术标本采用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，蜡块切成5 μm厚的切片。分离、水化后，120°C下蒸压30 min，pH值为6.0。将样品置于3%的氢过氧化物酶/甲醇中，阻断内源性过氧化物酶的活性，室温保存10 min。采用5%山羊血清于室温下孵育10 min。抗VASH1抗体和抗VASH2抗体以1∶500稀释和1∶100稀释的抗CD34抗体为原始抗体，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后，4°C反应过夜，室温下以组织纤维单色染色MAX（M）作为二抗，室温下反应30 min。用3，3'-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）四盐酸盐和0.005%双氧水在50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中显影，用苏木精染色细胞核。用PBS代替原抗体作为CD34抗原、VASH1和VASH2的阴性对照。所有切片均进行HE染色。

1.3 MVD 计数标准

采用抗CD34抗体，使用免疫组化染色方法显示肿瘤内微血管，对微血管密度最高的区域（热点区域）进行低倍率（×40）扫视，选取5个微血管密度最高的热点区域，用高放大倍率（×200，0.74 mm）计数5个区域染色的微血管数量，取其平均值表示MVD值，该热点为VASH1阳性血管。MVD阳性表达定位于血管内皮细胞膜，呈棕褐色表达，阳性表达的单个内皮细胞或内皮细胞簇与邻近血管、肿瘤细胞及其他结缔组织成分清楚分开即为1个可计数的微血管，然后将每个热点区域的血管数量转换为每一平方毫米的数字，为微血管密度（microvessel density，MVD）值[9]。

1.4 染色结果判定标准

VASH1和VASH2阳性染色定位于细胞质，呈棕黄色颗粒沉淀，根据其阳性细胞所占百分比进行评分：阳性细胞所占百分比为0%计0分，1%～50%计1分，51%～100%计2分。

1.5 随访

每6个月对全部患者进行1次随访，随访截至2018年12月18日，随访内容包括内镜、计算机断层扫描（CT）、超声检查和血液检测（检测肿瘤标志物水平）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示。采用Cox比例风险回归模型对ESCC患者总生存期和无病生存期的影响因素进行单因素和多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 患者总生存期影响因素的单因素分析

单因素分析结果显示，静脉侵犯、pN分期、VASH1高表达和VASH2高表达均可能是ESCC患者总生存期的影响因素（P＜0.05），而年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、浸润性生长情况、MVD值和辅助化疗情况均可能与ESCC患者的总生存期无关（P＞0.05）。（表1）

表1 ESCC患者总生存期影响因素的单因素分析

2.2 ESCC 患者总生存期影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的变量纳入Cox比例风险回归模型中进行多因素分析，结果显示，静脉侵犯阳性、pN分期为N1～4期、VASH1高表达和VASH2高表达均是ESCC患者总生存期的独立危险因素（P＜0.05）。（表2）

表2 ESCC患者总生存期影响因素的多因素分析

2.3 ESCC 患者无病生存期影响因素的单因素分析

单因素分析结果显示，静脉侵犯、pN分期和VASH1表达情况均可能是ESCC患者无病生存期的影响因素（P＜0.05），年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、浸润性生长情况和MVD值均可能与ESCC患者的无病生存期无关（P＞0.05）。（表3）

表3 ESCC患者无病生存期的单因素分析

2.4 ESCC患者无病生存期影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的变量纳入Cox比例风险回归模型中进行多因素分析，结果显示，静脉侵犯阳性、pN分期为N1～4期和VASH1高表达均是ESCC患者无病生存期的独立危险因素（P＜0.05）。（表4）

表4 ESCC患者无病生存期的多因素分析

3 讨论

血管生成是指在现有血管的基础上形成新的血管网络的现象。肿瘤血管生成在肿瘤的发生发展和远处转移中起重要作用[10]。近年来，关于恶性肿瘤血管生成与患者预后的关系已有多篇报道，加速了血管生成抑制剂的发展和临床应用。VASH1参与血管生成的抑制过程，有研究认为其不仅表达于生理性血管生成过程中，且表达于病理性血管生成的疾病中[11]。VASH1在乳腺癌、肝细胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌、大肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌和头颈部鳞状细胞癌等恶性肿瘤中均表达[12]，VASH1高表达患者的预后较差。有研究显示，VASH1蛋白阳性表达ESCC患者的中位生存时间明显短于VASH1蛋白阴性表达患者，VASH1为ESCC患者预后的影响因素[13-14]。

本研究认为VASH1和VASH2表达可能能够用于预测ESCC患者的预后。VASH1表达于血管生成部位的血管内皮细胞，CD34在新生和非新生的血管内皮细胞中均表达。基于此特点，可通过确定两种血管类型的比例计算新生血管在所有血管中的比例，从而反映血管生成的活性。由于VASH1是一种血管生成抑制因子，高表达的VASH1可能能够抑制血管的生成，从而改善患者预后。然而，亦有研究表明，VASH1过表达与患者的预后较差有关，这可能与VASH1是由VEGF和FGF-2诱导内皮细胞分泌的有关[15]。VASH1的强度与肿瘤细胞中VEGF的强度呈正相关，然而，VASH1在肿瘤微环境中分泌后会被降解和灭活。因此，VASH1在内皮细胞中的免疫组化染色结果可能并不能明确其抗血管生成的活性，而仅可反映内皮细胞对血管生成刺激的反应。基于此，VASH1高表达患者的抗血管生成活性高于VASH1低表达的患者。

VASH2是VASH1的同系物，是亲血管生成因子。VASH2具有促进肿瘤血管生成和肿瘤生长的作用。VASH2高表达的胰腺导管腺癌患者的预后相对较差[16]。同样，本研究中VASH2阳性表达ESCC患者的预后较差。关于VASH2在ESCC中的表达情况与预后关系的研究目前较少见[17]，本研究为VASH2的研究提供了有价值参考依据。有研究发现，VASH2的自分泌和旁分泌作用模式可通过上调肝癌细胞中核因子-κB的表达从而促进FGF-2和VEGF的表达[18]。VASH2不仅可促进肿瘤血管的生成，还可促进肿瘤细胞的增殖。VASH2可通过调控转化生长因子-β信号通路，促进肿瘤细胞发生上皮-间充质转化，因此，VASH2还参与肿瘤细胞的侵袭和迁移等多种生物学行为，并影响患者的预后。有研究发现，ESCC组织中VASH1和VASH2的表达水平均未升高，恶性程度相对较低，患者预后较好[19-20]。

综上所述，VASH1和VASH2高表达均是预测ESCC患者预后不良的独立危险因素，联合检测VASH1和VASH2的表达情况有助于ESCC的临床诊治与预后预测。