肠易激综合征中肠道菌群与活性氧的相关性研究

柯少雄， 杨长青， 魏子白

长治医学院附属和平医院消化内科，山西 长治 046000

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是最常见的功能性胃肠道疾病之一，在世界范围内的发病率是10%～25%，其主要临床表现是慢性腹痛、腹泻、便秘及排便习惯的改变[1]。目前尚无有效治疗手段，且其发病机制尚不明确，但内脏高敏感性作为IBS特征性病理、生理机制已经得到公认。近年来的研究显示，肠道菌群在IBS患者内脏高敏感中起重要作用，但其具体作用机制尚不清楚。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物体氧化代谢过程中活跃的中间产物。最新研究显示,肠道菌群可诱导肠上皮细胞内ROS的产生，从而参与内脏疼痛的发生。因此，本文将对该研究领域作一概述。

1 内脏疼痛中ROS的产生及其机制

1.1 ROS概述ROS是一类小分子物质，包括：超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和次氯酸(HClO)等[2]。人们首次发现ROS是在巨噬细胞中，并且是由NADPH氧化酶系中的NOX2催化产生。

迄今为止，已经发现的NOX家族成员共有7个：NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2。每个NOX家族成员都有其独特的细胞定位和功能，如：NOX2除了在巨噬细胞中表达外，还可在非巨噬细胞中表达，包括：神经细胞、心肌细胞及骨骼肌细胞，NOX1和DUOX2可在肠上皮细胞中强烈表达[3]。NOX酶的生理功能包括：参与宿主防御、蛋白质的翻译、细胞的信号传导、基因表达的调控和细胞分化等。

一般而言，ROS在生物体内存在时间较短，这是由于生物体内抗氧化系统包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等的清除作用。生理条件下，ROS的生成和清除处于动态平衡，一旦ROS的产生和清除失衡，将会导致氧化应激，损伤多种大分子物质，如：脂质、蛋白质、核酸等，并参与多种胃肠道疾病的发生[2, 4]。还有研究[5]表明，肠道内的氧化应激可能是IBS的潜在病因。近来研究发现，内脏疼痛的发生过程与ROS的产生密切相关。

1.2 ROS与内脏疼痛的关系慢性疼痛的特点是痛觉系统的敏化，导致对伤害性刺激和无害刺激的反应增加，以及在无任何刺激的情况下自发产生疼痛。在多种细胞，慢性疼痛过程总伴随着ROS的产生，且ROS对于疼痛的病理生理至关重要。越来越多的证据表明，ROS与疼痛过程有着紧密的联系。KALLENBORNGERHARDT等[6]研究显示，ROS可通过激活GTP酶Rab7，从而介导炎症性疼痛的过程。在动物实验中，大鼠脊髓损伤后，ROS可通过激活钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ而介导神经病理性疼痛，提前给予自由基清除剂的对照组则表现出钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的激活减少，神经病理性疼痛减弱[7]。ROS也能在癌性骨痛中起重要作用，且自由基清除剂对其治疗有效[8]。总之，这些研究证明了氧化应激确实参与了炎症性疼痛和神经病理性疼痛的发生机制。

然而，对于氧化应激在内脏疼痛中的作用却知之甚少。最新研究表明，ROS可能参与内脏高敏感的发生。VACULIN等[9]研究显示，结直肠扩张(colorectal distension，CRD)模型作为内脏痛模型的使用能增加动物体内的氧化应激反应，且这种反应能被提前给予的抗氧化剂阻断。WANG等[10]将酵母多糖注入大鼠结肠内，记录结肠扩张后腹肌收缩的肌电图(electromyograms，EMGs)作为内脏疼痛的指标，结果发现大鼠结肠EMGs增强、H2O2的浓度升高，且使用苯基叔丁基硝基酮(phenyl N-tertbutylnitrone，PBN)处理后(腹腔、鞘内、结肠内给药)可显著降低酵母多糖诱导的EMGs增强作用。有研究[11]表明，与对照组相比，在感染后IBS患者的结肠活检上清液总抗氧化能力显著减弱，肥大细胞活化增加，且蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2，PAR2)mRNA在肥大细胞中的表达显著增加，给予PBN后，肥大细胞活性明显减弱，PAR2 mRNA的表达明显降低。这些结果提示感染后IBS患者结肠内ROS增加，且ROS作为刺激物和炎症介质能使内脏伤害感受器兴奋和过敏，并参与伤害性信号的级联反应和伤害感受器的敏化。还有研究[12]显示，用2,4,6,-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎模型中，结肠组织内H2O2的含量增加，且H2O2浓度的增加可能是通过激活瞬时受体电位阳离子通道A1(transient receptor potential ankyrin 1 cation channel，TRPA1)从而介导内脏痛觉过敏。

2 肠道菌群介导生成的ROS在内脏疼痛中的作用

2.1 肠道菌群与内脏疼痛的关系在一个健康成人的胃肠道中定居着1013～1014个微生物，其数量是人类基因组所含基因的100倍。有证据表明，肠道菌群紊乱在IBS内脏疼痛的发病机制中起重要作用[13]。有研究[14]显示，将对CRD敏感的IBS患者的粪便移植到无菌大鼠身上，结果显示这些大鼠对CRD的反应增强。LUCZYNSKI等[15]实验结果显示，在无菌小鼠中，参与疼痛处理的前扣带回皮质和中脑导水管周围灰质的体积分别减少和扩大，且前扣带回皮质的树突变化非常明显，这表明肠道菌群是感受内脏疼痛所必需的。

最近，随机双盲安慰剂对照试验显示益生菌制品对缓解IBS症状有效，包括腹痛、腹部不适、腹胀和消化不良等[16-17]。另有研究[18]显示，经过8周的治疗，与安慰剂组相比，大肠埃希菌DSM17252对298例IBS患者的腹痛和全身疼痛评分均有明显改善。还有临床研究表明，某些益生菌可能参与调节IBS腹痛，有学者通过对24篇有关益生菌治疗IBS的文献作出的Meta分析数据显示，益生菌能减轻IBS患者的腹痛和降低症状严重程度的评分[19]。

最新研究还发现，非可吸收性抗生素利福昔明对于改善IBS患者症状有一定的疗效。XU等[20]在通过应激建立的内脏高敏感大鼠模型的研究中发现，利福昔明可改变大鼠回肠菌群的组成，并可预防慢性应激引起的黏膜炎症、肠道屏障功能损伤和改善内脏痛觉过敏。有研究[21]表明，在1 074例首次给予利福昔明治疗有效的腹泻型IBS患者中，382例未复发，692例复发。在这些人群中，636例随机给予利福昔明(n=328)或安慰剂(n=308)重复治疗，结果发现利福昔明的有效率显著高于安慰剂(38.1%vs31.5%，P=0.03)，对腹痛的有效率也显著高于安慰剂(50.6%vs42.2%，P=0.018)，在预防复发、耐久反应和排便方面也有显著改善。

虽然目前的证据表明肠道菌群与内脏疼痛的发生紧密相关，且益生菌、抗生素利福昔明等均可改善IBS患者腹痛症状，但其具体机制仍不清楚。

2.2 肠道菌群对肠上皮细胞内ROS生成的影响人体内高浓度的ROS是由巨噬细胞在杀菌过程中产生的。巨噬细胞内的甲酰肽受体(fomylated peptide receptors，FPRs)与激动剂结合后，在NOX2酶的催化下引发“呼吸爆发”，产生大量超氧化物[22]。FPRs是一种与G蛋白偶联的七次跨膜受体，最初在巨噬细胞的表面被发现，是一组研究较清楚的模式识别受体。人体有三种结构相关的FPRs，即FPR1、FPR2、FPR3。在功能上，FPRs可感受和结合含有细菌特异性的N-甲酰基肽，其中一个实例就是甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF)。FPR1对fMLF具有极高的亲和力，其半数有效量(ED50)在纳摩尔范围内，而FPR2对fMLF的亲和力较低[23]。实验观察到FPR1缺陷小鼠对病原体的易感性增强，提示FPR1在急性炎症过程中起作用，突出了这些受体的重要性。

除巨噬细胞外，NOX酶家族也存在于许多非巨噬细胞中，在肠上皮细胞中有NOX1和DUOX2大量表达。我们已知在巨噬细胞中，激动剂与FPRs结合可导致ROS的产生，而这恰好成为检测宿主-共生菌相互作用后肠上皮细胞中产生ROS的基本原理和出发点。这一观点通过在肠上皮细胞表面发现功能性FPRs而得到证实，提示FPRs在肠黏膜的生理过程中具有相似的功能[24]。有研究[25]表明，乳酸杆菌可刺激小鼠远端小肠和结肠中的FPR1受体，通过NOX1酶迅速产生生理浓度的ROS，并刺激结肠中的ROS依赖性细胞增殖。ALAM等[26]研究显示，肠上皮细胞与共生菌接触后通过NOX1和DUOX2酶的催化可产生O2和H2O2。另有研究[27]表明，小鼠回肠和结肠上皮细胞可通过依赖NOX1酶的方式，介导ROS的产生，并维持肠道菌群的稳态，而在NOX1基因敲除小鼠身上则未观察到ROS的产生，且其回肠细菌数量比正常小鼠更多。此外，肠上皮细胞与乳酸杆菌的接触可引起蛋白质的氧化增加，包括硫氧还蛋白和谷胱甘肽，并诱导氧化还原依赖性调控蛋白的转录。

尽管在宿主肠上皮细胞中大多数被检测的细菌都具有一定诱导产生ROS的能力，但这些菌群诱导肠上皮细胞内ROS产生的能力各不相同，其中乳酸杆菌诱导产生ROS的能力最强[22]。这可能是由于乳酸杆菌可提高其穿透黏膜层的能力，或增强其黏附性与肠上皮细胞表面受体(如：FPRs)接触。

2.3 ROS介导内脏疼痛的机制由NOX酶催化产生的ROS如H2O2，现在被认为是许多细胞内信号通路的关键调节因子。ROS调节细胞信号传导的机制是通过氧化特定的活性半胱氨酸残基实现的，而这些基团位于控制细胞信号通路激活的酶中。因此，含有活性半胱氨酸残基的蛋白质具有氧化还原感受器的功能，并传导由ROS介导的信号。最新研究表明，ROS氧化活性半胱氨酸残基这一性质，对于内脏疼痛的发生具有重要意义。

有研究[28]表明，特定的氧化还原信号通常涉及蛋白质中巯基残基的可逆氧化，因此改变这些基团的结构可能导致蛋白质功能的改变。目前已经发现这样的蛋白质有多种，包括：瞬时受体电位阳离子通道、N-甲基-D天冬氨酸受体、T型钙离子通道、γ-氨基丁酸受体等都被发现可感知ROS并通过依赖氧化还原的方式改变其自身活性[29]。有研究[6]发现，ROS通过氧化Rab7介导炎症性疼痛过程，而Rab7是一种含有半胱氨酸残基的小GTP酶。在KOGURE等[12]实验中，H2O2可通过激活TRPA1介导内脏疼痛。在此之前已有学者报道H2O2可通过氧化细胞内活性半胱氨酸残基从而激活TRPA1。另有研究[11]表明，与对照组相比，感染后IBS患者的结肠活检上清液总抗氧化能力显著降低，肥大细胞活化增加，且PAR2 mRNA在肥大细胞中的表达显著增加，给予PBN后，肥大细胞活性明显减弱，PAR2 mRNA的表达明显降低，这提示ROS可能是通过氧化活性半胱氨酸残基来激活PAR2，再进一步促进肥大细胞脱颗粒，从而介导内脏疼痛。

3 总结与展望

IBS的发病机制尚未明确，但内脏疼痛作为其核心症状已经得到众多学者的认可。本文通过概述IBS患者中肠道菌群可通过介导ROS的产生从而导致内脏疼痛，从另一个角度解释了内脏疼痛的发病机制，这是研究ROS在胃肠道的作用中取得的巨大进步，但ROS导致内脏疼痛的具体机制还有待进一步阐明。因此，对这一领域的研究对于我们更深一步认识IBS具有重要意义，一方面，可以帮助阐明IBS内脏高敏感的不同机制，另一方面，为抗氧化剂通过抑制ROS的活性来缓解IBS患者腹痛症状提供了理论基础。相信对该领域的深入研究，将会使IBS的病因和发病机制进一步明确，从而为临床提供更多指导和帮助。