中性粒细胞胞外诱捕网在胃肠道中的应用

李虹萱，许张轩，吴清云，邹小明

哈尔滨医科大学附属第二医院胃肠外科，黑龙江 哈尔滨 150086

中性粒细胞已被认为是先天免疫应答的主要影响因素之一。它们具有多种免疫功能，包括吞噬作用、活性氧物种(ROS)产生和脱颗粒，以及由中性粒细胞胞外诱捕器的解聚染色质丝组成的黏性网状结构的形成和释放[1]。这些结构由组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白修饰，最初被认为是中性粒细胞捕获和杀死病原体的机制。事实上，抑制中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成会导致小鼠和人对细菌感染的易感性增加[2]。虽然NETs的成分具有杀菌活性，但过量的NETs具有促炎特性，并损伤宿主细胞[3]。因此，NETs在许多其他疾病中也常被研究讨论，包括系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎、糖尿病、血栓和肺损伤[4-6]。

越来越多的证据表明，尽管NETs有助于对抗严重的感染，然而它们也参与炎症的加重、自身免疫性疾病的发生、癌症的发展和血栓形成[3]。随着检测技术和影像学技术的发展，NETs的存在正逐渐被接受；NETs的研究已经从体外观察延伸到体内器官水平，并扩展到许多特异性疾病领域。NETs除了在糖尿病、关节炎、SLE和囊性纤维化中的作用外，在胃肠道系统和肝脏系统方面的作用也有所报道，例如炎症性肠病、肝癌等[7-8]。虽然NETs是一个新的领域，但人们仍寄予厚望，希望NETs能有助于阐明药物的致病机制，并制定新的诊断和治疗策略。在这篇综述中，我们阐述了与胃肠道感染、炎症、自身免疫和癌症有关的NETs的最新发现。

1 NETs的形成机制

1996年，使用佛波醇酯(PMA)最大限度地激活中性粒细胞，观察到中性粒细胞的分叶状核解散并聚集，核膜破裂，核物质填充胞质空间和细胞膜破裂[9]。这一过程与细胞凋亡或坏死明显不同。虽然这些观察资料以前被认为是一种莫名其妙的中性粒细胞死亡，但关键的进展是认识到这一过程不仅仅是中性粒细胞死亡，而是一种显性的细菌分离机制。事实上，BRINKMANN等[8]证明了释放的染色质被各种中性粒细胞抗菌分子所覆盖，并将其结构命名为NETs结构。他们通过使用PMA和IL-8对其刺激分析离体的NETs，但在体内也证明了阑尾炎患者的组织样本与NETs结合，NETs具有对抗毒力因子和杀死细菌的能力。

NETs至少有两种形成的机制：氧化剂依赖性和氧化剂独立性。此外，并非所有的NETs的形成都会导致细胞死亡，并非所有的中性粒细胞死亡必然促使NETs形成，即使DNA在细胞外渗漏。在很多文献中，把NETs的形成称为NETosis，用其描述NETs的形成，并非所有的NETs形成都导致细胞死亡，若其特定方面被验证，我们将在其裂解或非裂解之前使用“NETs形成”一词。

2 NETs与胃肠道感染

在人类胃肠道中可以发现许多种类的细菌、真菌和寄生虫，它们都可促进NETs的形成[10-16]。在这些微生物中，金黄色葡萄球菌[10]、大肠杆菌和白念珠菌[11]已被证明可诱导活性氧独立性的快速非裂解NETs的形成。NETs对细菌入侵起到的防御作用毋庸置疑；然而，活化中性粒细胞与肠细胞样Caco-2细胞共培养模型显示，NETs可能通过直接与NETs相关联的蛋白接触而损伤上皮细胞[17]。此外，CRANE等[18]认为，在细菌性肠炎模型中，通过增强微生物膜的作用可以使NETs帮助致病型大肠杆菌和志贺氏大肠杆菌黏附在肠黏膜上。结果表明，NETs在胃肠道感染和炎症中可能是一把双刃剑。

一些微生物如金黄色葡萄球菌[19]、化脓性链球菌和幽门螺杆菌[20]可以通过使用核酶降解细胞外DNA，因此具有逃脱NETs介导的捕获和杀灭的潜在能力，这表明核酸酶在发病因素中的重要性。然而，核酸酶的抑制有助于清除病原菌，而LL37等抗微生物肽可以在阳离子性质的基础上稳定NETs对抗细菌核酸酶的降解[21]。人阳离子抗菌肽β防御素-3和人中性粒细胞防御素-1在保护中性粒细胞来源的DNA，防止核酸酶的降解方面有类似的作用[22]。除了使用核酸酶外，大肠杆菌通过产生肠杆菌素抑制中性粒细胞活性氧的生成、NETs的形成、脱颗粒和吞噬，这是一种儿茶酚酸酯铁载体，它能分离细胞内铁和中性粒细胞中易分解的铁池[23]。细菌也适应了NETs的其他逃避机制。例如，铜绿假单胞菌对NETs的抗性更强，诱导的NETs比金黄色葡萄球菌或大肠杆菌少[24]。虽然NETs的DNA骨架具有对铜绿假单胞菌的杀菌作用，但病原体通过修饰其外膜表面耐受有害作用。这些感知和防御NETs的能力可能是另一个重要的免疫逃避机制。

3 NETs在胃肠道炎症中的应用

中性粒细胞及其胞外诱捕网在许多类型的炎症相关胃肠道疾病中都有重要作用。在这些疾病中，中性粒细胞的参与在肝脏疾病的模型中得到了最好的研究，如酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、药物性肝损伤和缺血再灌注损伤[25]。然而,由于这些模型都与坏死相关，其中胞外DNA是它们共同的特征，因此NETs与游离DNA为非等价关系。事实上，与中性粒细胞特异性细胞内分子(如弹性蛋白酶)相关的染色质可以作为NETs的较好证据。例如，在研究NETs是否通过使用乙酰氨基酚过量小鼠模型参与药物性肝损伤的发病机制时，发现在富含DNA的坏死区域中有嗜中性粒细胞的积累，但与DNA相关的弹性蛋白酶未被检测到，提示NETs并未释放。事实上，尽管通过CXC趋化因子受体-2阻断了中性粒细胞募集，但依旧有类似水平的细胞外DNA积累在肝脏中。因此，药物诱导的肝损伤模型中的DNA沉积不是来源于NETs，而是来自死亡的肝细胞[26]。髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶均被报道在各种肝炎中起到有害作用，包括酒精性脂肪性肝炎和NASH[27-29]，意味着这些中性粒细胞衍生的调节剂对药物性肝损伤的发生有一定的作用，但它们独立于NETs而释放。然而，如果坏死物质产生过多，那么NETs的产生可以被掩盖。

4 NETs与肿瘤进展的关系

中性粒细胞在肿瘤相关炎症和免疫学中的作用得到了广泛的关注，但同样，结果也不尽相同。淋巴细胞比率已被认为是肝癌、胰腺癌和结肠癌等患者预后不良的独立指标[30-32]。患者研究和小鼠癌症模型都提示有两种嗜中性粒细胞表型，因此称为抗肿瘤N1嗜中性粒细胞和促瘤性N2中性粒细胞[33-34]。N1中性粒细胞显示ROS诱导的直接抗肿瘤以及抗体依赖性细胞毒素作用。此外，这些中性粒细胞可以激活CD8+T细胞和树突状细胞，甚至可能存在于肿瘤抗原中[33]。同时，N2中性粒细胞被认为通过促进细胞外基质的重建、促进血管生成和淋巴管生成以及促进肿瘤细胞因子的产生促进肿瘤的发展[34]。虽然假定中性粒细胞对N1或N2表型进行极化，但使该过程发生的具体条件尚不清楚。

越来越多的证据证明了NETs的形成在肿瘤发展中起重要作用。然而，NETs形成过程中的抗肿瘤发生与促肿瘤发生的作用可能是相辅相成的。例如，MILLRUD等[35]研究显示，高CD16和低CD62L中性粒细胞群体的迁移和NETs形成能力的增加，与头颈部鳞癌患者更好的生存有着密切的联系。这些中性粒细胞和NETs可能杀死肿瘤细胞，但另一方面，在小鼠中的几项研究表明，由系统性细菌感染或外科应激引起的血管内NETs形成促进了肝和肺的肿瘤转移[8，36]。NETs的DNA网状物捕获循环癌细胞，但不能杀死或损伤这些转移细胞[8]。血管内NETs也增加血管通透性，使癌细胞从脉管系统渗出。此外，过度富营养化胞外诱捕网通过血管内皮钙黏蛋白降解和β-联蛋白信号通路的激活促进内皮细胞向间充质转化[37]。在另一项研究中，β1整合素在NETs和癌细胞上的表达似乎对循环癌细胞与NETs的黏附很重要[38]。在此过程中，抑制NETs的形成将有利于防止癌症扩散。高表达粒细胞集落刺激因子的转移性乳腺癌细胞也诱导NETs类似物结构的形成，但其发生在肺播散后，其重要性不明确[39]。综上所述，N1和N2中性粒细胞均可在癌组织中产生NETs，然而，它们的功能似乎不同，癌症的类型或进展程度是否决定其功能尚不清楚。需要进一步研究N1和N2中性粒细胞在NETs形成和功能上的差异。

在胃肠系统中，已经证实胃、肠、肝和胰腺肿瘤的发生可能与NETs形成有关[40-44]，因为在对小鼠癌症模型或癌症患者的组织样本进行免疫染色时，明显检测到NETs形成与疾病进展密切相关。在自发性小肠癌模型中，通过补体C3a过敏性趋化受体的上调以及补体系统的活性，产生具有N2表型特征的低密度中性粒细胞[44]。结肠腺癌患者的组织标本显示在肿瘤中存在NETs以及相关的转移淋巴结。中性粒细胞和NETs来源于组织因子，在肿瘤微环境中起到促进血管生成活性的作用[43]。

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，其中80%～90%的患者在诊断时已经发生转移。一项研究发现胰腺癌细胞表面存在胞外DNA，这增加了CXCL8的产生，并表明其有助于癌细胞的侵袭和血管生成。研究表明，通过降低细胞外DNA和CXCL8的表达，胰脱氧核糖核酸酶能抑制胰腺癌转移。该研究是少数NETs抑制癌细胞转移的例子之一。胰腺癌细胞可以通过未知的机制快速诱导NETs形成[45]。此外，在胰腺癌小鼠模型和胰腺导管腺癌患者中都检测到了NETs形成。通过氯喹对自噬的抑制作用或对晚期糖基化终产物受体的基因消蚀作用(RAGE，也称为GER)，可减少肿瘤微环境中NETs的形成[41]。尼古丁对于咽喉、肺、食管、胃、肝、胰脏和膀胱癌是公认的危险因素，通过尼古丁乙酰胆碱受体诱导NETs形成，并依赖Akt和PAD4激活[46]。实际上，NETs的形成可能促使癌症发生，使潜在的抑制剂成为癌症治疗过程中重要的发展方向。

除了吞噬作用、脱颗粒和氧化剂产生外，中性粒细胞可以诱捕和杀死病原体也是NETs形成的重要作用。中性粒细胞通过NETs的形成发挥抗菌作用，以根除感染。这一过程使肝脏成为体内NETs形成的中心器官。一些病原体已经获得了逃避或截获NETs的抗菌活性系统。因此，了解这些机制可以在严重感染中发现有效的治疗靶点。NETs相关分子也可能作为生物标志物，并作为胃肠道炎症、自身免疫和癌症相关疾病的治疗干预的靶标。然而，与任何免疫调节方法一样，在任何条件下权衡NETs形成的利弊都至关重要。作为胃肠道系统中的一个新兴领域，NETs与微生物组之间的关系也已经成熟。