促甲状腺激素与视网膜新生血管形成*

孙译遥 邬 宏杨光燃，#

促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone, TSH)主要通过与促甲状腺激素受体(Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR)结合，作用于甲状腺滤泡细胞以调节甲状腺细胞的增殖，以及甲状腺激素的合成与分泌。越来越多的研究发现甲状腺外组织及细胞可表达TSHR[1-3]。TSH通过与其结合后可能发挥不同的作用。视网膜新生血管形成主要见于糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)、早产儿视网膜病(Retinopathy of Prematurity, ROP)及视网膜中央静脉阻塞(Central Retinal Vein Occlusion, CRVO)等[4,5]，是视网膜病变的主要致盲原因，高水平TSH与DR的相关性[6]及高TSH水平对ROP的影响[7]均提示TSH与视网膜新生血管形成有关。本文综述TSH对甲状腺外组织——视网膜血管新生作用的相关研究。

1 TSH的作用

TSH是腺垂体嗜碱细胞合成的一种糖蛋白激素，分子量约28kD，由α亚单位(92肽单链)和β亚单位(112肽单链)组成[8]。血液循环中TSH水平接受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素及甲状腺分泌的甲状腺激素反馈调节。TSH主要通过与甲状腺滤泡上皮细胞上的TSHR结合调节甲状腺细胞的增殖、甲状腺血液供应以及甲状腺激素的合成和分泌，对维持正常甲状腺功能尤为重要。TSHR属于嘌呤核苷酸调节蛋白(G蛋白)耦联受体[8]，以往认为TSHR仅分布于甲状腺滤泡上皮细胞膜；后续研究发现，TSHR还广泛存在于大脑、睾丸、肾脏、心肌、骨骼、脂肪组织、纤维母细胞、肝脏和微血管内皮细胞等多种甲状腺外组织和细胞[1-3]。TSH通过与甲状腺外的TSHR结合，促进脂肪分解，介导骨再塑、促进骨形成，参与肝功能调节，促进胆固醇合成[2]，对机体生长发育有积极作用。

2 TSH与视网膜新生血管

血管生成分为血管发生和血管新生两个主要过程。血管新生过程较为复杂，首先是血管扩张、血管通透性增加，继而血管内皮细胞发生增殖、迁移，形成血管腔，在各种细胞及大量细胞因子参与下，最终形成新生血管。在这个过程中，血管内皮细胞起着重要作用，内皮细胞的增殖是整个过程的中心环节[9]。TSH与最常见的引起视网膜新生血管形成的三种疾病(DR、ROP及CRVO)可能有直接联系。

2.1 TSH与DR

国外研究表明，甲状腺功能异常在普通人群中的发生率为5%-8%，而在糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)患者中发病率为13%—32%[10-12]，是前者的2-4倍。DM患者的甲状腺功能异常又以亚临床甲状腺功能减退(Subclinical Hypothyroidism, SCH)最常见，占全部甲状腺功能异常的40%以上[13, 14]。且随着年龄增加，病情迁延，DM患者SCH发生率逐年增高，还有临床研究发现DR患者的SCH发生率明显高于对照组[15, 16]，其中女性患者TSH升高率约为男性患者的2.7倍[17]。

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)患者中20%-40%可能出现DR，其中8.9%的患者丧失视力[18]。对于DR引起的较高致盲率，目前公认其风险与DM病程长、血糖的控制水平差、高血压及高血脂有关；而面对DR患者中相对高的SCH患病率提示对于较高水平TSH是否也是DR的独立危险因素,多个临床研究报道了SCH较高TSH与DR存在相关性。郭丹[19]对162例T2DM患者进行分析，发现SCH组DR发生率显著高于单纯DM组(32.5% vs 14.5%，P<0.05)，在校正年龄、性别、病程、糖化血红蛋白等变量后，SCH仍是DR的危险因素(OR=2.747，95%CI: 1.556-4.005)，即TSH高水平与DR发生呈正性相关。另有研究按照DR国际临床分类法的分期，观察了各期DR与SCH患病率的相关性。Kim等[20]选取了489例韩国DM患者，检测血糖、甲状腺功能的同时进行的DR筛查，结果表明SCH组较甲状腺功能正常组的严重视网膜病变(包括严重增殖性和非增殖性DR)的发生率增加(32.8% vs 19.6 %，P<0.05)；Yang等[16]的研究显示，严重DR，尤其是威胁视力的DR(Sight Threatening Diabeteic Retinopathy，STDR)的发病趋势在SCH组中更高(OR=4.15, 95% CI=2.17-7.96,P<0.01)；而对于甲状腺功能正常，TSH水平在2.0-4.0uIU/ml的T2DM患者，其STDR的发病率较TSH水平在0.4-2.0uIU/ml患者高，同样提示TSH水平与STDR有正性关系；袁娟等[21]对157例T2DM患者的病例对照研究也得到了相似结果。还有Wu等[6]在SCH与DR相关性Meta分析中，纳入了2007-2012年间8个病例对照研究进行Meta分析，结果发现，SCH可使DM患者DR风险增加2.13倍(OR=2.13, 95% CI=1.41-3.23,P<0.01)。但SCH(较高TSH)与DR二者的相关性也存在不一样结果。如陈吉海等[22]对400 例年龄大于65岁的老年T2DM患者进行DR筛查时发现，SCH与其DR的发生无明确相关性，Chen等[14]对台湾地区DM患者的研究也得到相似结果。综合分析这些报道出现与上不同结论的原因可能大多由于样本量不足，入选人群和条件各异，排除标准和所用统计学方法不同等所致，用此否定SCH与DR的正相关性并不可取。

2.2 TSH与ROP

ROP是发生于早产和低体重儿的一种致盲性视网膜病变，其病理特征为视网膜血管异常增生。ROP的发展可分为两个时期，即血管闭塞期和新生血管形成期。血管闭塞期血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factors-1, IGF-1)等与血管生成相关因子表达显著降低，而新生血管形成期新生血管相关因子表达显著增加。ROP的主要发病机制是新生血管过度形成[23]。正确分析ROP的发病机制，首先要明确视网膜血管发生与新生血管过度形成是结局完全不同的两个过程，前者是形成正常视网膜血管结构所需，而后者是糖尿病增殖性视网膜病变、 ROP、 CRVO等视网膜病变的主要致盲原因[5,24]。TSH等甲状腺功能指标与ROP的关系也是相关研究关注的重要内容。在基础研究方面，Martina等[25]在动物实验中观察到甲巯咪唑(Methimazole, MMI)对新生大鼠ROP有影响，当给予母鼠含0.1%MMI饲料喂养，并母乳喂养新生大鼠10日时发现，MMI组新生大鼠血清甲状腺素(Thyroxine, T4)水平明显低于正常对照组(P<0.01)，同时对新生大鼠行视网膜铺片、腺苷二磷酸酶染色，观察到MMI组新生血管形成为31%，对照组为0%。提示MMI在降低血清T4水平的同时，可引起病理性新生血管过度形成。在Mutapcic等人[7]的研究中对1日龄新生SD大鼠腹腔注射T4(1.0μg/g)3天或7天后进行视网膜分离、腺苷二磷酸酶染色后评估视网膜新生血管密度，同时检测血清T4、TSH及IGF-1水平，结果发现无论药物干预3天或7天，血清T4水平均升高，TSH水平均降低，新生血管密度均较对照组减少，注射3天组与对照组比较为：16.8 ±1.4 (支/mm) vs 18.3±1.3(支/mm),P<0.05；注射7天组与对照组比较为：14.4±1.3(支/mm) vs 16.8±1.1(支/mm),P<0.01；而血清IGF-1水平两组差异无统计学意义。提示T4干预可降低TSH水平和减少视网膜血管密度，增加了无血管区面积，进而导致局部缺氧，于新生血管形成期VEGF表达增高，ROP发生风险也随之上升[26]。

临床上对此研究较少，已有报道结果与上述动物实验结果并不一致。Korkmaz等[23]对56例存在ROP风险的早产新生儿(对照组)及63例严重视网膜新生血管形成的患儿(观察组)进行了回顾性分析，借以了解TSH和游离甲状腺素(Free Thyroxine, FT4)与视网膜新生血管形成的关系，结果发现两组间TSH和FT4水平差异无统计学意义(P>0.05)，即TSH等与新生血管形成无关。但对此结果，不宜苟同，因其为回顾性病例对照研究，文中有的对照组入选了无ROP的早产低体重新生儿以及已有轻度视网膜新生血管形成的患儿，而且并非所有研究对象都同时进行TSH和FT4检测，而是根据这些早产儿的出生时间来确定检测时间，如果患儿27周前出生，在胎龄32周时或更早测定，如果30周以后出生的患儿则在胎龄34周时测定，另外也不清楚TSH和FT4检测是否与视网膜检查时间同步。因此还需要大样本、前瞻性临床研究以进一步客观验证TSH与ROP的相关性。

2.3 TSH与CRVO

CRVO是常见的高致盲率视网膜血管病之一, 常因新生血管形成等并发症而使视力下降[27],推测其可能由于视网膜缺血缺氧影响了血管增殖平衡，视网膜细胞分泌 VEGF等增加，继而促进了新生血管形成[28]。但目前在万方数据库、CNKI及Pubmed数据库尚未检索到关于TSH 与CRVO的相关性研究报道。

3 TSH与视网膜新生血管形成的可能机制研究

Hoffmann等[29]在细胞水平研究了TSH对VEGF分泌的影响，并初探了TSH引起甲状腺细胞增殖的相关信号通路。该研究选择了3种细胞株——甲状腺未分化癌细胞(Human Undifferentiated Thyroid Cancer Cell Line, HTC)，该细胞缺乏内源性TSHR而不表达TSHR，HTC-TSHR是HTC经携带TSHR 环状脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)病毒转染后的重组细胞，该细胞稳定表达功能性TSHR，Hurthle甲状腺癌细胞株是高分化甲状腺肿瘤细胞，可通过环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP)途径高表达TSHR。研究中分别给予三种细胞不同浓度TSH(0.1mU/ml、1mU/ml、10mU/ml、100mU/ml)，并对VEGF基因、蛋白及相关通路因子水平进行测定。结果发现，HTC细胞因不表达TSHR ，药物干预后的VEGF水平无明显变化；使用TSH加cAMP拮抗剂干预则使三种细胞的VEGF平均水平下调15%；使用TSH加蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)作用于三种细胞，其VEGF水平上升，当使用PKC抑制剂干预三种细胞后，75%细胞的VEGF水平明显下降。表明TSH与TSHR结合通过cAMP/PKC通路使甲状腺肿瘤细胞的VEGF上调，更进一步通过在细胞水平、信号通路验证了TSH-TSHR-VEGF-细胞增殖的作用。

TSHR也存在于其它甲状腺外组织，且TSH对于甲状腺外组织的作用已引起较多关注。Balzan等[30]研究了TSH对人早期真皮微血管内皮细胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell Line, HMEC-L) 及人心微血管内皮细胞(Human Primary Cardiac Microvascular Endothelial Cells, HMVEC)的作用，他们通过RT-PCR、Western-Blotting及免疫荧光技术检测TSHR的表达，在显微镜下观察毛细血管网的形成状态，结果发现两种细胞膜上均存在TSHR表达；当使用1mIU/ml的TSH干预细胞，可以促进两种细胞形成毛细血管网，而在培养皿中分别加入TSHR抗体(2μg/ml)及VEGF抗体(2μg/ml)可抵消TSH的作用。这项研究以磷酸化核糖体p70S6K1，即雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)的下游靶点为检测抗体，发现在TSH干预HMEC-L后1.5h， p70S6K1磷酸化水平提高近2倍(P<0.05)，但使用TSHR抗体后p70S6K1磷酸化明显受抑。另外，TSH干预后，三种细胞的蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB)及细胞外调节蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinases, ERK)磷酸化水平也轻度升高，进一步证实TSH干预后细胞增殖增加。因而认为TSH在甲状腺外组织——HMEC-L和HMVEC膜上与TSHR结合后通过cAMP-mTOR信号通路发挥促血管生成作用。

4 小结与展望

大量临床横断面研究发现罹患SCH的DM患者更容易发生DR，尤其是增殖性视网膜病变，提示较高TSH水平可能与视网膜新生血管形成有关。细胞和分子水平研究表明TSH促血管增殖作用通过TSH-TSHR-VEGF通路实现，TSH对甲状腺外组织的作用与cAMP-TOR信号通路激活有关。TSH与CRVO视网膜新生血管的相关性有可能通过基因敲除及基因过表达技术以及大量动物实验及基因、蛋白水平的检测获取结果。期待对TSH与视网膜新生血管形成关系进行全面深入的研究，为SCH机制相关疾病防治做出新贡献。