脑钠肽联合miR-328基因对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌损伤的影响

梁雁翎 魏 勇 王兆东 马 骏 迟增鑫 郝诗苑

心血管病是引起人类死亡的一个主要原因[1]。心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI)可引发心力衰竭和再梗死、心律失常等并发症，给患者的生命健康造成严重威胁[2]。大量研究表明，MIRI的发病机制复杂，涉及炎性浸润、凋亡障碍、自由基损伤、白细胞和微血管功能障碍等，这些机制彼此互连，互为因果，是导致心肌细胞凋亡及坏死的最终结果[3]。脑钠肽(BNP)是继心房利钠肽之后属于利钠肽系统的第二个成员，在心脏分布最多，对多种心血管疾病具有保护作用[4]。miRNAs是一类在进化上保守，由长约22个核苷酸组成的单链非编码小RNA，可通过与靶mRNA的3′UTR结合，促进靶mRNA在转录后降解或抑制靶mRNA的转录后翻译，最终引起多个靶基因的表达沉默[5]。大量研究表明，miRNAs在MIRI、心力衰竭、心肌梗死等多种心血管疾病中发挥关键作用[6,7]。miR-328是miRNAs家族成员之一，有研究发现，miR-328在急性冠脉综合征(ACS)患者血浆中水平升高，可作为ACS诊断及鉴别诊断的潜在生物标志物[8]。MIRI可上调心肌组织miR-328表达，过表达miR-328可加重心肌损伤，而miR-328的特异性拮抗剂可减轻H2O2诱导的心肌损伤[9]。本研究建立大鼠MIRI模型，旨在探讨BNP联合miR-328对MIRI模型大鼠心肌组织炎症反应、氧化应激及细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验使用动物及动物的护理符合美国国家卫生研究院颁布的实验动物使用指南(NIH Publication NO.85-23，revised 1996)，健康成年SPF级Wistar雄性大鼠50只，体重250-300g，由青岛市动物实验动物中心提供。大鼠于恒温恒湿的动物房内常规喂养。适应性饲喂1周后用于实验研究。

1.2 主要试剂

miR-328 antagomir试剂(剂量：200μl，批号：m153325)购自广州锐博生物有限公司；冻干粉重组人脑利钠肽(rhBNP)(批号：国药准字S20050033)购自成都诺迪康生物制药有限公司；总RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen(批号：1382739)；伊文思蓝、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(批号：C004-3)及肌酸激酶MB同工酶检测试剂(CK-MB)(批号：C0023-2)购自南京建成生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(批号：20161210)购自美国Sigma； 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒(批号：BA1054)购自中国C-USABIO; 白细胞介素-10(IL-10)ELISA检测试剂盒(批号：2015C107)购自美国R&D公司；TUNEL试剂盒(批号：C1089)购自碧云天生物技术有限公司；Bcl-2抗体(批号：2772S)、Bax抗体(批号：2762S)和NF-κB p65抗体(批号：8242)均购自美国CST。

1.3 实验动物分组及处理

按照随机数字表法将大鼠分为5组，假手术组(Sham组)、MIRI组(I/R组)、脑钠肽组(BNP组)、miR-328组和BNP+miR-328组，每组10只。各组大鼠处理方法如下：Sham组：给予大鼠0.5% CMC-Na(10ml/kg)溶液灌胃，开胸暴露心脏，只穿线不结扎动脉；I/R组：给予大鼠0.5% CMC-Na(10ml/kg)溶液灌胃，开胸暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支45min，再灌注3h，建立MIRI模型；BNP组：开胸前将BNP以0.01μg/kg静脉注射一次给药，余同I/R组；miR-328组：开胸前尾静脉注射miR-328 antagomir 200μl，余同I/R组；BNP+miR-328组：开胸前采用前述方法注射BNP及miR-328 antagomir，余同I/R组。

1.4 大鼠MIRI模型制备

MIRI模型的建立参考Cao[10]等方法。采用结扎左冠状动脉前降支45min，再灌注3h的方法建立。所有大鼠均造模成功。

1.5 检测指标和方法

1.5.1ELISA法检测血清CK-MB、IL-10、TNF-α含量：再灌注结束后，大鼠处死前，通过心脏穿刺收集血液10ml，室温保存30min，4℃离心，吸取上层血清，于-80℃冰箱冻存，采用ELISA检测血清CK-MB、IL-10、TNF-α的含量。所有步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2TTC+伊文思蓝双染色法检测心肌梗死面积：再灌注结束后经大鼠颈静脉注射2ml伊文思蓝染料(1.5%)，断头取心脏，将右心室和心房剔除，PBS冲洗，将左心室用眼科剪剪成2mm厚的切片，于1% TTC溶液中避光37℃染色10min，通过Image-Pro Plus3.0图像分析系统分析每个切片的梗死面积及缺血面积，以两者的百分比表示心肌的梗死面积。

1.5.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-328 mRNA表达：Trizol法提取Sham组、I/R组和miR-328组大鼠心肌组织总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，采用20μl反应体系，PCR反应程序：94℃10min后，按94℃ 15s、60℃15s和72℃ 30s，循环35次，每孔设置6个重复孔。引物由上海吉玛设计合成。以U6作为内参基因，按照 2-△△Ct法计算各组心肌组织miR-328 mRNA的相对表达水平。

1.5.4TUNEL法检测心肌细胞凋亡率：断头处死大鼠后取心脏，以磷酸缓冲液洗涤，制备厚度为5 μm的石蜡切片(乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋)，经TUNEL染色检测各组大鼠心肌细胞的凋亡率情况。

1.5.5硫代巴比妥酸(TBA)法及邻苯三酚法检测MDA和SOD水平：心肌组织氧化应激损伤通过脂质过氧化物及活性氧评价。断头处死大鼠后取心脏，生理盐水清洗，取距离结扎远端2mm处心肌组织，于-80℃冰箱冻存，采用TBA法及邻苯三酚法测定心肌组织MDA含量及SOD活性(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)，以此评价心肌组织中氧自由基及脂质过氧化物水平。检测步骤按试剂和仪器要求执行。

1.5.6Western blotting检测心肌组织Bcl-2、Bax及NF-κB p65蛋白表达：大鼠断头处死后摘取心脏，提取心肌组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白上样，每孔30μg，经10% SDS-PAGE分离，电转分离蛋白于PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭膜1h，经Bcl-2、Bax及NF-κB p65抗体4℃孵育过夜，加HRP标记的兔抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜，ECL显影。GAPDH为内参照。采用Image-J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH蛋白条带灰度值比值作为该蛋白相对表达量。每组实验重复3次。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织miR-328表达的比较

各组大鼠心肌组织miR-328表达差异有统计学意义。I/R组miR-328 mRNA表达(2.138±0.215)显著高于Sham组(0.975±0.098)(t=9.915,P<0.05)，而miR-328组miR-328 mRNA表达(0.532±0.078)显著低于I/R组(t=13.692,P<0.05)。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积和血清CK-MB水平比较

Sham组、I/R组、BNP组、miR-328组和BNP+miR-328组心肌梗死面积百分比分别为0、(32.46±2.02)、(17.82±1.11)、(20.34±1.43)、(10.03±0.86)，CK-MB含量(U/L)分别为(4.65±0.72)、(14.18±1.31)、(8.23±1.01)、(9.62±0.96)、(5.71±0.54)，组间差异均有统计学意义(F=270.765、47.166，P<0.05)。与Sham组比较，I/R组心肌梗死面积及CK-MB水平明显升高(t=31.240、12.347，P<0.05)，与I/R组比较，BNP组和miR-328组心肌梗死面积及CK-MB水平明显降低(t均>7.709，P<0.05)，而BNP+miR-328组心肌梗死面积及CK-MB水平均显著低于BNP组和miR-328组(t均>3.265，P<0.05)。

2.3 各组大鼠血清IL-10和TNF-α水平比较

Sham组、I/R组、BNP组、miR-328组和BNP+miR-328组IL-10含量(ng/L)分别为(6.48±0.84)、(4.13±0.32)、(11.24±1.03)、(9.18±0.96)、(17.74±1.56)，TNF-α含量(ng/L)分别为(34.65±2.65)、(97.68±6.32)、(54.36±4.16)、(65.53±5.07)、(31.27±2.14)，差异均有统计学意义(F=78.001、114.842，P<0.05)。与Sham组比较，I/R组IL-10含量明显降低(t=2.816，P<0.05)，TNF-α含量明显升高(t=17.752，P<0.05)，与I/R组比较，BNP组和miR-328组IL-10含量明显升高(t=8.519、6.051，P<0.05)，TNF-α含量明显降低(t=12.201、9.055，P<0.05)，而BNP+miR-328组IL-10含量显著高于BNP组和miR-328组(t=7.788、10.257，P<0.05)，TNF-α含量显著低于BNP组和miR-328组(t=6.503、9.649，P<0.05)。

2.4 各组大鼠心肌组织MDA和SOD水平比较

Sham组、I/R组、BNP组、miR-328组和BNP+miR-328组MDA含量(nmol/L)分别为(6.06±0.54)、(17.11±1.06)、(11.34±0.87)、(12.62±0.94)、(7.67±0.67)，SOD活性(U/mg)分别为(58.69±6.77)、(24.54±2.63)、(36.58±3.74)、(31.17±3.21)、(49.95±5.12)，差异均有统计学意义(F=80.847、28.212 ，P<0.05)。与Sham组比较，I/R组MDA含量明显升高(t=16.165，P<0.05)，SOD活性明显降低(t=9.204，P<0.05)，与I/R组比较，BNP组和miR-328组MDA含量明显降低(t=8.441、6.568，P<0.05)，SOD活性明显升高(t=3.245、3.787，P<0.05)，而BNP+miR-328组MDA含量显著低于BNP组和miR-328组(t=5.369、7.241，P<0.05)，SOD活性显著高于BNP组和miR-328组(t=3.603、5.061，P<0.05)。

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

Sham组、I/R组、BNP组、miR-328组和BNP+miR-328组心肌细胞凋亡率(%)分别为(1.43±0.17)、(33.54±2.75)、(18.07±1.47)、(21.26±1.56)、(10.12±0.96)，差异均有统计学意义(F=166.667，P<0.05)。与Sham组比较，I/R组心肌细胞凋亡率明显升高(t=24.289，P<0.05)，与I/R组比较，BNP组和miR-328组心肌细胞凋亡率明显降低(t=11.702、9.289，P<0.05)，而BNP+miR-328组心肌细胞凋亡率显著低于BNP组和miR-328组(t=6.014、8.427，P<0.05)。

2.6 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax和NF-κB p65蛋白表达水平比较

Sham组、I/R组、BNP组、miR-328组和BNP+miR-328组心肌组织NF-κB p65蛋白表达分别为(0.106±0.012)、(0.714±0.072)、(0.275±0.032)、(0.286±0.035)、(0.134±0.016)，Bcl-2蛋白表达分别为(0.384±0.042)、(0.096±0.010)、(0.151±0.017)、(0.195±0.021)、(0.424±0.045)，Bax蛋白表达分别为(0.026±0.005)、(0.224±0.025)、(0.137±0.015)、(0.158±0.016)、(0.076±0.009)，差异均有统计学意义(F=113.637、68.825、71.884，P<0.05)。与Sham组比较，I/R组NF-κB p65和Bax蛋白表达明显升高(t=18.814、15.576，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(t=11.605，P<0.05)，与I/R组比较，BNP组和miR-328组NF-κB p65和Bax蛋白表达明显降低(t均>5.192，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显升高(t=2.216、3.989，P<0.05)，而BNP+miR-328组NF-κB p65和Bax蛋白表达显著低于BNP组和miR-328组(t均>4.363，P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著高于BNP组和miR-328组(t=11.001、9.228，P<0.05)。

3 讨 论

本研究旨在证实BNP和miR-328单独或联合应用对MIRI大鼠心脏的保护作用及可能机制。大量研究发现，MIRI可激活炎症反应、氧化应激、心肌细胞凋亡和坏死、心肌梗死等[11,12]。本研究结果显示，与Sham组比较，I/R组血清CK-MB含量及心肌梗死面积均升高，表明I/R可导致心肌损伤，也说明模型建立成功。而BNP和miR-328 antagomir均可降低CK-MB含量及心肌梗死面积，表明BNP及miR-328 antagomir可减轻采用结扎左前降支方法大鼠心梗模型的MIRI。

本研究发现BNP和miR-328 antagomir均可上调抗炎因子IL-10水平及下调促炎因子TNF-α水平以达到抗炎作用，两者联合使用对IL-10和TNF-α水平影响更明显。炎症反应包括促炎因子释放及中性粒细胞浸润，TNF-α可进一步刺激IL-6、IL-1β、趋化因子等促炎因子从浸润的白细胞及内皮细胞中释放，因而引起细胞因子的级联反应[13]。目前已有大量研究表明TNF-α、IL-6和IL-1β可促进MIRI[14]。与此同时，也有炎性因子对心脏损伤具有修复作用，如IL-10在MIRI中可通过下调炎症反应减轻心肌损伤[15]。因此，本研究结果提示BNP和miR-328 antagomir可通过抑制I/R引发的炎症反应对MIRI起保护作用。

本研究结果显示，BNP和miR-328 antagomir均可下调脂质过氧化因子MDA含量及上调抗氧因子SOD活性， 联合使用时可起到协调作用，对二者影响更明显。多种因素均可引起MIRI，而MIRI可诱导氧化应激并启动脂质体氧化、DNA和蛋白质损伤，最终引起心脏损伤[16]。目前认为氧化应激是导致MIRI的一个主要机制。自由基是氧化应激引起MIRI的主要参与者，SOD活性及MDA含量可反映氧化应激程度。SOD是机体自由基清除能力的重要标志物之一[17]。MDA是脂质过氧化反应的终产物，其水平升高可造成细胞损伤[18]。本研究结果提示BNP和miR-328 antagomir均可通过降低氧化应激对心脏损伤起保护作用，二者联合作用效果更明显。

本研究结果显示，BNP和miR-328 antagomir均可抑制心肌细胞凋亡，联合使用对细胞凋亡抑制更明显。有研究表明，在心肌细胞凋亡MIRI过程中发挥关键作用，是心功能不全、心肌损伤生理病理过程发生发展的重要环节[19,20]。NF-κB参与多种细胞因子的调控，尤其与炎症有关的细胞因子，p65/p50是最常见的形式[21]。研究表明，I/R可活化NF-κB，而NF-κB活化后可对心肌细胞凋亡起促进作用，抑制NF-κB活性可改善氧自由基清除功能，降低细胞凋亡率，减轻MIRI损伤[22,23]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族关键成员，Bcl-2和Bax在I/R过程中发挥保护或加速细胞凋亡作用，Bcl-2和Bax比值降低可抑制细胞凋亡，比值升高可促进细胞凋亡[24]。本研究结果显示，BNP和miR-328 antagomir均可下调Bcl-2和NF-κB p65水平，上调Bax水平，二者联合使用后调节作用更明显。

综上所述，本研究发现脑钠肽和miR-328 antagomir均可降低炎症反应、减轻氧化损伤、降低心肌细胞凋亡率，从而对MIRI起保护作用，而联合使用效果更明显，机制可能是下调NF-κB p65信号。本研究提示脑钠肽联合miR-328可能是心血管疾病治疗的有效途径。