二参汤对心力衰竭大鼠模型AngII 通路的干预与影响

王亚萍，王 萌，周丽雅

（1.吉林工程技术师范学院校医院，长春 130000；2.长春中医药大学附属医院传统诊疗中心，长春 130022；3.长春中医药大学基础医学院，长春 130117）

近年来，大量研究证明炎性反应是导致CHF病理及生理的重要机制之一，且对于其炎症通路及炎性细胞因子的研究也成为目前的研究热点。当前各项研究证实，AngII本身是一种强大的促炎症因子，它能够激活循环中的白细胞，并通过合成黏附分子、趋化因子等参与白细胞黏附至活化的内皮细胞[1-2]。同时AngⅡ还是 RAAS系统的主要活性物质，体内的RAAS系统被激活，导致血管紧张素II（Ang II）的释放增加，激活核因子-κB（NF-κB），进一步激活 TLR4，触发细胞信号级联反应，而最终导致NF-κB 转录因子依赖的信号途径的整体激活，进而形成各种炎性因子对血管壁的浸润，使得CRP等炎性因子的过度表达，最终产生炎症反应。因此，促炎症因子AngII、核转录因子NF-κB和非特异性炎症反应物CRP的测定可以作为CHF病理、生理状态及预后评价的一种标志物。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠160只，体质量（250±20）g，由长春中医药大学实验中心提供。

1.2 药物 1）药物二参汤：党参20 g，丹参20 g，川芎15 g，麦冬10 g，五味子10 g，木香10 g，降香10 g，薤白15 g，元胡15 g。生药由长春吉林省中医院制剂中心提供，由其中药房代煎，长春中医药大学实验研究室浓缩而成，其中药液含生药量为3. 36 g/mL，4℃冰箱保存。2）成药：缬沙坦，北京诺华制药有限公司，规格： 80 mg×7粒/盒，批号：201604。

1.3 试剂 兔抗鼠NF-κB p65单克隆抗体（C-20）：ZS-372，北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,北京中杉金桥生物技术有限公司；CRP ELIsA试剂盒，R&D system公司；碘[125I]血管紧张素II（AII）放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所。

1.4 主要仪器 旋涡混合器（上海XW-80A）；超声器（MODELCV188）；数显恒温水箱 （金坛HH-W-420）；震荡培养箱（哈尔滨HZQ-X100）；酶联免疫检测仪（上海DG5031）。

1.5 动物造模与分组 160只雄性Wistar大鼠随机分出10只为假手术组，仅穿线不结扎冠状动脉左前降支（全部存活） ；余下的150只大鼠参照文献[3-4]采用结扎冠状动脉左前降支的方法来建立急性心肌梗死大鼠模型，使用心脏彩超测定其心脏射血分数（ejection fraction, EF）＜60% 为造模成功，共43只，进而值筛选出EF指数最低的30只，随机分为缬沙坦组、中药组、模型组各10只。

1.6 给药 假手术组和模型组给予灭菌蒸馏水每只2 mL/d，中药组给药量每只2.085 g/kg，缬沙坦组给药量每只20 mg/kg。1次/d，连续灌胃28 d。

1.7 观测项目

1.7.1 观测各组心肌组织形态学变化 灌胃28 d后，实验大鼠采用眼球取血法，并摘取心尖部部分心肌组织，于10% 福尔马林溶液中固定一部分心肌组织；另一部分心肌组织于－80℃冰箱低温保存。经Masson染色法处理取部分心肌组织，观测其形态学的变化。

1.7.2 检测各组心肌NF-κB的蛋白表达 采用Western blot实验检测其心肌NF-κB的蛋白表达。于实验大鼠左心室处提取50 mg心肌，同时提取总蛋白，电泳先以60 V电压开始，至溴酚蓝指示剂进入分离胶后，再将其电压调整到120 V直至电泳结束。再于100 V恒压转膜60 min，随后将膜移入含有5% 脱脂奶粉的0.1%Tween20的TBST溶液的自封袋中，在室温下于摇床内封闭l h。加一抗TLR4（1：200）、NF-κB p65（1：500），4℃冰箱过夜。次日再用TBST洗膜3次；再加入二抗（1：5000）于室温内在摇床内摇动1 h。TBST洗膜3次，将A、B发光液以1：1的比例均匀混合，1 min后将混合液滴加于膜上，并使用保鲜膜封包。于暗室内使用X光片曝光后常规方法显影、定影，随后用Image J软件分析。

1.7.3 检测各组血清中CRP的浓度 使用大鼠血清因子ELISA试剂盒，检测各实验组大鼠血清标本中CRP的浓度。

1.7.4 检测各组 AngⅡ浓度 采用放射免疫分析分析药盒测定组织、血浆AngⅡ的放射性计数（cpm）；之后用log-logit处理数据，得出结果（CONC）。

1.8 统计学分析 运用SPSS 15.0数据分析软件分析处理各项数据。结论得出每组实验数据均为正态分布，方差齐，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠心肌组织形态学改变 1）假手术组：大鼠心脏Masson染色以红色的心肌细胞为主，且心肌组织间分布均匀，结构清晰，细胞排列整齐，细胞间隙窄，且心肌细胞间质与周围血管之间无明显绿色胶原纤维。2）模型组：CHF大鼠心肌细胞间质、血管周围均可见大量的绿色胶原纤维沉积，并有瘢痕形成，部分心肌组织已被胶原纤维组织所取代，心肌细胞肥大，且围绕于心肌细胞的胶原纤维出现断裂、排列紊乱，细胞间隙增宽，血管壁增厚，纤维化程度重。3）给药组：各给药组CHF大鼠心肌间质纤维化程度介于上述2组之间，但较模型组均有不同程度的减轻，其中二参汤组与缬沙坦组无明显差异。见图1。

图1 各组心肌组织形态学改变

2.2 各组药物对CHF 大鼠心肌NF-κB 表达的影响 见图2、表1。

图2 各组药物对CHF 大鼠心肌NF-κB 表达的影响

表1 各组药物对 CHF 大鼠心肌NF-κB蛋白表达量的比较（ ） pg/mL

表1 各组药物对 CHF 大鼠心肌NF-κB蛋白表达量的比较（ ） pg/mL

注：与模型组比较，# P＜0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01

组 别 n NF-κB假手术组 10 12993.38±198.67#模型组 10 108335.01±176.54△△二参汤组 10 32244.94±215.96#缬沙坦组 10 31463.57±228.09#

2.3 各组血清中CRP含量比较 见表2。

表2 各组血清中CRP含量比较（ ） pg/mL

表2 各组血清中CRP含量比较（ ） pg/mL

注：与模型组比较，# P＜0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01

组 别 n CRP含量假手术组 10 1236.23±32.72#模型组 10 2151.68±11.05△△二参汤组 10 1479.43±14.41#缬沙坦组 10 1535.29±29.74#

2.4 各组 AngⅡ浓度比较 见表3。

表3 各组 AngⅡ浓度比较（ ，n = 10） pg/mL

表3 各组 AngⅡ浓度比较（ ，n = 10） pg/mL

注：与模型组比较，# P＜0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01

组 别 心肌中 AngⅡ含量 血浆中 AngⅡ含量假手术组 629.30±27.05# 220.75±16.26#模型组 1480.73±16.30△△ 759.09±7.15△△二参汤组 938.49±27.06# 435.23±14.29#缬沙坦组 955.78±29.76# 454.55±13.42#

3 讨论

研究证实，AngII本身是一种强大的促炎症因子，它能够激活循环中的白细胞，并通过合成黏附分子、趋化因子等参与白细胞黏附至活化的内皮细胞。通过对RAAS系统的深入研究，已经发现一条心衰的炎症反应链，即体内的RAAS系统被激活，导致Ang II的释放增加，激活NF-κB，形成各种炎性因子对血管壁的浸润，使得TNF-α、IL-6及CRP等炎性因子的过度表达，最终产生炎症反应。有研究证实，Ang II可以上调TLR4的表达，这可能是Ang II的致炎作用之一[5]，并且它通过TLR4/NF-κB通路介导血管平滑肌细胞的炎性反应[6]。研究证明，AngⅡ是 RAAS系统的主要活性物质，在正常生理状态下，心肌局部的AngⅡ水平基本保持在10～8 mol/L左右，调节血管收缩及水盐代谢；但在高血压、心肌缺血或心力衰竭等病理条件下，心肌组织局部的AngⅡ水平便能上升到10～7 mol/L以上，而此时则能够导致心肌肥大及血管重构。近些年通过对RAAS系统的深入研究，人们已经发现一条心衰的炎症反应链，即Ang II释放→激活NF-κB→启动细胞因子CRP最终导致炎症反应。所以Ang II无论是从RAAS系统，还是从炎症通路，均能促使心力衰竭的进一步发展和恶化，所以抑制Ang II的升高，便能够切段该反映链，进而在一定程度上控制心衰的发展。

本次实验结果显示，模型组AngII含量最高，假手术组含量最低，各给药组含量均较模型组有所降低，其中以二参汤组最为显著。说明二参汤、缬沙坦均能抑制AngII的生成，在一定程度上阻断Ang II在CHF中的传导途径，对控制CHF的进一步发展起到了作用。