莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

刘雁霞，刘思佳，王 慧，黄梦倩，王 岩，樊振川

(天津科技大学大健康生物技术国家国际科技合作基地，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

莱茵衣藻(C.reinhardtii)是当今国内外研究纤毛结构和组装的主要模式生物之一，是结构简单的单细胞真核藻类[1]．纤毛缺失或信号传导功能障碍会造成一系列的疾病，统称为纤毛病，其中巴德-毕氏综合征(Bardet-Biedl syndrome，BBS)是一种罕见的常染色体隐性遗传纤毛病，其常见的症状有视网膜变性、肾囊肿、肝脏纤维化、肥胖、先天性心脏病等．目前已鉴定出的基因有21 种[1]．

BBSome 复合物蛋白主要存在于纤毛膜与纤毛轴丝之间的区域，可与纤毛膜上的受体结合，具有信号传导作用．BBS1 最初由Mykytyn 发现，bbs1 是一种常见的BBS 综合征突变基因，由它引起的突变约占30%，BBS1 可与BBS3b 直接连接，通过BBS3b与纤毛内运输蛋白(IFT)结合，运送至纤毛顶端，参与完成信号传导[1-2]．

为进一步研究BBSome 与IFT 蛋白的相互作用关系，本实验室需制备检测莱茵衣藻内BBS1 的抗体，通过扩增bbs1 基因片段，连接至pET-28a(+)表达载体，表达融合蛋白6×His-BBS1，获得多克隆抗体，为进一步研究BBSome 与IFT 蛋白的相互作用，以及BBSome 蛋白是如何完成纤毛的信号传导作用奠定分子基础．这也是首次用莱茵衣藻bbs1 全基因序列制备兔抗莱茵衣藻多克隆抗体．

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 质粒及菌株

莱茵衣藻(C.reinhardtii)CC-125 野生型藻种、莱茵衣藻(C.reinhardtii)bbs1 突变型藻种、大肠杆菌(E.coli)XL1-blue、质粒pET-28a(+)、感受态细胞均由本实验室保存．

1.1.2 试剂

限制性内切酶、蛋白marker，美国Thermo 公司；100 bp、1 kbp DNA marker、T4 DNA 连接酶由北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒，天津润泰科技发展有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，美国Omega Bio-Tek 公司；Protein A SepharoseTMCL-4B 抗体纯化介质，美国GE Healthcare 公司；其他试剂与报道文献一致[3]．免疫实验由华大蛋白质研发中心有限公司进行．

1.2 方法

1.2.1 表达载体构建

莱茵衣藻bbs1 cDNA 长度为1 731 bp，且序列不含BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，设计引物序列为F：5′-CCATGCTGCCATCAGTCAAG-3′、R：5′-GGCTCCACCTCCTCCGGCTC-3′，下划线部分为限制性内切酶切位点，由苏州金唯智生物有限公司合成．bbs1 cDNA 全基因序列通过PCR 获得[3]. PCR 产物纯化后，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，同时双酶切表达载体pET-28a(+)，分别回收大小为1 731 bp 的目的基因和5 344 bp 的载体片段．回收后将载体和目的基因按照摩尔质量1﹕3 的比例室温连接1 h，同时设置对照组；转化至大肠杆菌(E.coli)XL1-blue，抗性平板(100 μg/mL 卡那霉素)37 ℃过夜培养14～16 h；挑取转化子至液体LB 培养基培养过夜，提质粒后BamHⅠ和HindⅢ双酶切进行验证，正确则测序．

1.2.2 诱导表达

将测序正确的重组质粒pET-28a(+)-bbs1 进行诱导表达，诱导方法参照文献[4]，诱导16～18 h 后，4 ℃、8 000g 离心2 min，收集菌体．加入裂解液/结合液(50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑)将菌体重悬(20 mL 裂解液重悬200 mL 菌体)，超声破碎细胞．分别收集部分全蛋白，上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE 电泳，鉴定表达融合蛋白存在于上清液或沉淀[5]．

1.2.3 蛋白纯化

400 mL 菌体高压破碎后，4 ℃、12 000g 离心20 min，蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，弃上清液，将沉淀用裂解液重悬，清洗2 次．用含2 mol/L 尿素的裂解液清洗沉淀2 次后，最终用含8 mol/L 尿素的裂解液将沉淀完全溶解，4 ℃、12 000g 离心20 min，将上清液过0.22 μm 滤膜与1 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow 填料4 ℃结合1 h；弃流穿液，再用5 倍柱体积的裂解液(含8 mol/L 尿素)漂洗填料3 次；待漂洗液流干后加入用3 mL 洗脱缓冲液(50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)混匀，静置10 min 收集洗脱液，将收集到的洗脱液重新加入混匀，重复3 次，得到最终洗脱液，测定浓度和纯度．

1.2.4 免疫

首次免疫新西兰大白兔之前用75%酒精擦拭兔子耳部静脉[6]，插入静脉抽取阴性血100～200 μL，全血在室温静置30～120 min 后，1 500g 离心10 min，收集血清．首次免疫取免疫原400 μg，采用生理盐水稀释至200～500 μL，加入等体积的弗氏完全佐剂[7]混匀，形成油包水状态．进行背部多点皮下注射免疫，每10 d 加强免疫1 次，共加强免疫2 次．加强免疫取 200 μg 免疫原，用生理盐水稀释到 200～500 μL，再加入等体积弗氏不完全佐剂；用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水状态．

1.2.5 多克隆抗体效价测定

采用间接ELISA 法测定抗体效价[4]，用包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)稀释抗原，终质量浓度为2 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃过夜；后用PBS 洗涤2 次．封闭液(1% BSA 或脱脂奶粉/PBS)封闭，每孔200 μL，37 ℃孵育2 h；后用洗液洗涤1 次．将多抗血清从200 倍开始用PBS 作2 倍梯度稀释，空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200 倍稀释；每孔100 μL，37 ℃孵育1h；洗液洗涤3次，每 次10 min．以1﹕20 000 稀释比加入二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗液洗涤3 次，每次10 min．加入显色液(1% A 液+10% B 液，A 液为1%TMB 溶于DMSO，B 液为 0.1% H2O2柠檬酸缓冲液)每孔100 μL，显色时间为5～15 min；每孔加入50 μL 终止液终止．双波长(450 nm、630 nm)测定吸光度，记录保存数据并作图分析．多抗血清效价为1/2 最大吸光度所对应的稀释倍数．

1.2.6 多克隆抗体纯化及检测

Protein A SepharoseTMCL-4B 纯化血清[5]，稀释至1 mg/mL 后，留存备用．取20 μg 经过蛋白定量处理的莱茵衣藻上清液蛋白检测抗体特异性，进行12% SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭后以1﹕1 000 的稀释比孵育多克隆抗体，二抗采用HRP 标记的羊抗兔IgG(1﹕10 000 稀释)，进行ECL 显色．

1.2.7 免疫荧光定位莱茵衣藻中BBS1 蛋白

免疫荧光对莱茵衣藻内BBS1 蛋白定位，固定制片后，于室温下利用牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，用纯化后的BBS1 多克隆抗体(1﹕10 稀释比)室温孵育4 h，用荧光标记羊抗兔/小鼠二抗室温孵育1 h，封片后在荧光显微镜下拍照．

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET-28a(+)-bbs1 的构建

通过RT-PCR 扩增获得1 731 bp 的bbs1 目的基因，连接至载体后，转化挑取单克隆提取质粒并酶切验证．图1 为C.reinhardtii CC-125 总RNA 提取结果；图2(a)显示PCR 扩增产物，条带单一且大小正确；图2(b)显示重组表达质粒pET-28a(+)-bbs1 阳性克隆双酶切验证结果，双酶切后两条带大小与预期结果一致，经测序验证结果正确，说明表达载体pET-28a(+)-bbs1 构建成功．

图1 C. reinhardtii CC-125总RNA的提取 Fig. 1 Total RNA extraction of C. reinhardtii CC-125

(a) bbs1 基因PCR 扩增(b) pET-28a(+)-bbs1 的双酶切验证 (a)中M. 100 bp DNA marker；1. bbs1 基因PCR. (b)中M. 1 kbp marker；1. pET-28a(+)-bbs1 的BamHⅠ和HindⅢ双酶切

2.2 6×His-BBS1诱导表达及纯化

融合蛋白6×His-BBS1 由DNAMan 预测大小约6.3×104，添加IPTG 诱导后，经SDS-PAGE 分析显示，在5.5×104～7.0×104间条带，表达量略低，且融合蛋白大多以包涵体形式存在于沉淀中；约1 L 诱导后菌体经亲和层析纯化后蛋白质量浓度可达到0.5 mg/mL，共2.5 mg，经考马斯亮蓝染色，TBST 脱色后，利用软件Image J 对其进行灰度分析，纯度可达90%以上，可作为免疫抗原(图3)．

M.蛋白marker；1.诱导前对照；2.诱导后全细胞；3.诱导后上清液蛋白；4.诱导后沉淀蛋白；5.纯化后目的蛋白

2.3 抗体的效价及特异性检测

抗血清检测参照纤毛内运输蛋白IFT46 抗体制备方法[5]，采用间接ELISA 法测定，1/2 最大吸光度所对应的稀释倍数为1﹕102 400，因此多抗血清抗血清滴定度达到 1﹕102 400(图 4)．对抗血清进行SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色检测，在5.5×104和 2.5×104处可见较纯的抗体重链和轻链(图5)．免疫印迹法(Western blot)验证抗血清特异性结果如图6所示．

图4 间接ELISA法测定抗血清效价 Fig. 4 Determination of anti-BBS1 polyclonal antiserum with indirect ELISA

图5 抗血清SDS-PAGE纯度检测 Fig. 5 Determination of anti-BBS1 polyclonal antiserum purity with SDS-PAGE

(a)中1. 免疫前阴性血清检测莱茵衣藻CC-125；2. Anti-BBS1 多克隆抗体检测莱茵衣藻CC-125．(b)中1. Anti-BBS1 多克隆抗体检测莱茵衣藻CC-125；2. Anti-BBS1 多克隆抗体检测莱茵衣藻bbs1 突变体

经免疫印迹实验分析显示，纯化后的抗血清在 1﹕1 000 的稀释比下，在6.3×104处可见特异性结合条带，而在bbs1 突变体藻株中，无特异性结合条带，由此可知抗血清可与莱茵衣藻BBS1 蛋白发生特异性结合(图6)，表明所制备的多克隆抗体特异性好，灵敏度高．

2.4 BBS1蛋白在莱茵衣藻中的定位

通过免疫荧光技术对莱茵衣藻BBS1 蛋白进行定位分析，可通过荧光信号看出多克隆抗体可以与莱茵衣藻内的BBS1 蛋白进行特异性结合，且该蛋白可以进入莱茵衣藻纤毛内，该蛋白在细胞和纤毛中的分布可通过野生型藻种中红色荧光判断(图7)．由图7可知莱茵衣藻中BBS1 蛋白分布于基体部位以及在鞭毛中呈点状分布．

图7 免疫荧光检测BBS1蛋白在莱茵衣藻纤毛中的定位Fig. 7 Immunofluorescence detection of BBS1 protein localization in C. reinhardtii

3 结 语

BBSome 复合物蛋白主要存在于纤毛膜与纤毛轴丝之间的区域，与纤毛膜上分布的受体存在一定的关系，对纤毛的信号传导具有极其重要的作用，这也是大部分的BBSome 复合物蛋白在细菌内表达时，大多以包涵体的形式存在的原因．本文中与His 标签共表达的BBS1 蛋白也是以包涵体的形式存在，但GST 蛋白促溶与BBS1 融合表达时可以以上清液的形式存在．考虑到GST 标签过大，不易表达，且标签产生的抗体可能会影响后续抗血清的质量，因此选用His 标签蛋白与BBS1 融合表达作为免疫抗原．包涵体蛋白变性纯化后可直接免疫，整个标签大小约为4.3×103，一般不会影响蛋白的结构和功能；另外，通过组氨酸与金属离子(Ni2+)的螯合作用，对表达蛋白进行亲和层析纯化，方法体系很成熟．

免疫抗原的纯度越高所产生的抗血清质量越好，由于本次实验免疫抗原纯度达到90%以上，抗血清在经过一步纯化后就能够特异性地识别莱茵衣藻内的内源性BBS1 蛋白，为在莱茵衣藻中深入研究BBSome 复合物蛋白提供技术支持，为后续阐明其作用机理、纤毛病的预防和治疗提供理论依据．