参地颗粒对慢性肾小球肾炎脾肾亏虚证患者细胞毒T 淋巴细胞相关抗原-4∕外周单个核细胞B7-1介导的免疫炎症紊乱的影响

2019-12-20茅燕萍王亿平陈成张磊魏玲任克军金华王东章雪莲

广州中医药大学学报 2019年2期

茅燕萍,王亿平,陈成,张磊,魏玲,任克军,金华,王东,章雪莲

（安徽中医药大学第一附属医院肾病科，安徽合肥 230031）

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN）简称慢性肾炎，为免疫介导的肾脏损伤，已成为我国导致终末期肾病的首要病因[1]。糖皮质激素及细胞毒类药物等免疫抑制剂控制CGN蛋白尿的疗效显著，但其毒副作用较大，并存在全身免疫抑制而导致机会性感染的风险增加。中医药在调节免疫功能、减少免疫抑制剂所带来的代谢紊乱和抵抗力下降等方面有独特的作用。本课题组的前期研究结果认为，CGN的基本病机是脾肾亏虚、精微下注。参地颗粒由清朝新安医学名家程林所著《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》中的人参汤化裁而成，功效为健脾益肾、固摄精微[2]。前期大量临床研究[3-11]表明，参地颗粒可以明显改善脾肾亏虚型CGN患者的临床症状，降低证候积分，减少24 h尿蛋白定量及尿红细胞量。随着免疫学的快速发展，自身免疫性疾病的病变机制研究及治疗有长足的进步，免疫反应参与CGN病程已经得到广泛的证实和高度的重视。在参地颗粒的临床研究中也发现其对于患者免疫功能的调节作用[3，4]，尤其是对于T细胞活化及外周单个核细胞B7-1（CD80）水平的异常表达；在参地颗粒对于系膜增生性肾小球肾炎大鼠干预研究中也展现出了一定的调节能力[12]。B7-1作为重要的共刺激分子在抗原提呈细胞（anti-gen presenting cells，APC）表面表达，其与T细胞表面CD28分子相互结合可介导T细胞的增殖与分化，从而引起细胞与体液免疫。B7-1分子的配体为 T细胞表面的CD28∕CTLA-4。其中CD28作为正性信号可促进T细胞活化，外周细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）则是T细胞活化的下调因子[13]。大多数研究表明，触发CTLA-4可以下调整个T细胞群的增殖以及抑制细胞因子的合成。此外，CTLA-4∕B7-1与Th细胞密切相关，B7-1能促进Th细胞分化，产生白细胞介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN-γ），造成Th1∕Th2细胞紊乱，调节肾脏病的进展。因此，拟通过开展本研究以进一步明确参地颗粒对于CTLA-4∕B7-1介导的免疫炎症紊乱的调节机制，也为其临床应用提供必要的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组本研究病例均为2015年1月至2017年1月安徽中医药大学第一附属医院肾病科收治的符合纳入标准的脾肾亏虚型CGN患者，共60例。按就诊的先后顺序依随机数字表随机分为治疗组和对照组，每组各30例。另从本院体检中心选择20例同期健康体检者作为正常组。本研究符合医学伦理要求并获医院伦理委员会审核通过。

1.2 诊断标准 CGN诊断标准参照《内科学》[14]诊断标准。慢性肾脏病分期标准参照2012年国际肾脏病组织“改善全球肾脏病预后”（Kidney Disease；Improving Global Outcomes，KDIGO）分期标准[15]。中医辨证标准参照《中药新药临床研究指导原则》[16]制定的脾肾亏虚证标准。

1.3 纳入标准 ①符合上述西医学CGN诊断标准、慢性肾脏病分期标准及中医脾肾亏虚证辨证标准；②为慢性肾脏病Ⅰ、Ⅱ期患者（肾小球滤过率＞ 60 mL∕min）；③24 h尿蛋白定量（24hUPr）＜3 g者；④年龄为18～70岁；⑤自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1.4 排除标准 ①合并有心脑血管疾病或严重传染病患者；②正在服用激素、细胞毒药物者；③妊娠期或哺乳期妇女；④生活不能自理或患精神疾病，不能按规定服药者。

1.5 治疗方法

1.5.1 西医常规处理 2组患者均给予西医常规处理，包括：①低盐低脂饮食；②改善肾脏微循环；③对于高血压患者应控制血压低于140∕90 mmHg，降压药物的选择依次为钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂、中枢性降压药等。

1.5.2 治疗组在西医常规处理的基础上，给予参地颗粒治疗。用法：参地颗粒（药物组成：红参、茯苓、鸡内金、川芎、熟地黄、五味子、桑螵蛸；由安徽中医药大学第一附属医院中草药加工中心生产，规格：10 g×3包，每包含生药34 g；批准文号：皖药制字BZ20080025；生产批号：20140418），每日3次，每次1袋。

1.5.3 对照组给予缬沙坦胶囊治疗。用法：缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司生产，规格：80 mg×7粒；批准文号：国药准字H20040217），口服，每日1次，每次80 mg。

1.5.4 疗程 2组疗程均为12周。

1.6 观察指标及疗效评价

1.6.1 临床疗效评价参照《中药新药临床研究指导原则》[16]制定。其中症状量化评分，按照症状的无、轻、中、重分别计0、2、4、6分。临床疾病疗效分临床控制、显效、有效和无效4级；中医证候疗效分临床痊愈、显效、有效和无效4级。

1.6.2 24 h尿蛋白定量（24hUPr）采用常规生化法检测24hUPr，尿液标本分别于治疗前和治疗后每隔4周收集1次，共4次。

1.6.3 血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平检测运用酶联免疫法（ELISA）检测患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平。所有实验严格按照操作说明书进行。试剂盒均由上海源叶生物技术有限公司提供，生产批号分别为20161102A、20161122A、20161220A、20160122A、20160122A。

1.7 统计方法采用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，计数资料采用率或构成比表示。若资料符合正态分布且方差齐，两组间比较采用t检验，若资料不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验，多组间均数比较采用方差分析；单向有序定性资料采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者脱落剔除情况治疗组有2例患者因在治疗期间加用泼尼松，与本次试验病例选择标准不符而剔除；对照组有1例在治疗期间加服雷公藤多甙片，2例未按规定服用缬沙坦而剔除，共剔除3例。最终实际完成试验的治疗组为28例，对照组为27例。

2.2 2组患者及正常组的基线资料比较治疗组28例患者中，男16例，女12例；平均年龄（38.12±12.58）岁；平均病程为（3.55±1.32）个月；就诊时血压高于140∕90 mmHg者15例。对照组27例患者中，男13例，女14例；平均年龄（39.34±12.03）岁；平均病程为（3.26±1.38）个月；就诊时血压高于140∕90 mmHg者13例。2组患者的性别、年龄、病程及血压情况等基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。正常组20例健康体检者中，男10例，女10例；平均年龄（42.45±10.18）岁。3组受试者的性别、年龄等基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），也具有可比性。

2.3 2组患者治疗前后中医证候积分比较表1结果显示：治疗前，2组患者的中医证候积分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，2组患者的中医证候积分均较治疗前下降（P＜0.05），且治疗组的降低作用明显优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 2组患者治疗前后中医证候积分比较Table 1 Comparison of TCM symptom scores in the two groups before and after treatment （，s∕分）

①P＜0.05，与治疗前比较；②P＜0.05，与对照组治疗后比较

治疗后30.59±3.39①19.68± 2.33①②组别对照组治疗组N 28 27治疗前40.37±4.15 40.50±3.28

2.4 2组患者中医证候疗效及临床疾病疗效比较表2～表3结果显示：治疗组和对照组的中医证候疗效总有效率分别为92.86%、55.56%，临床疾病疗效总有效率分别为89.29%、62.96%；组间比较，治疗组的中医证候疗效和临床疾病疗效均优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 2组患者治疗前后24hUPr含量比较表4结果显示：治疗前，2组患者的24hUPr含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后各个时点，对照组的24hUPr含量与治疗前比较均无统计学差异（P＞0.05）；治疗组在治疗8周、12周后的24hUPr含量均较治疗前明显降低（P＜0.05），且其降低作用明显优于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

表2 2组患者中医证候疗效比较Table 2 Comparison of effect on TCM symptoms in the two groups n（p∕%）

表3 2组患者临床疾病疗效比较Table 3 Comparison of clinical efficacy on CGN in the two groups n（p∕%）

表4 2组患者治疗前后24hUPr含量比较Table 4 Comparison of 24hUPr in the two groups before and after treatment （，m∕g）

治疗12周后0.99±0.12 0.54± 0.12①②组别对照组治疗组N 27 28治疗前1.76±0.56 1.76±0.66治疗4周后1.64±0.45 1.63±0.52治疗8周后1.29±0.75 0.98± 0.79①②

2.6 2组患者治疗前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比较表5结果显示：治疗前，2组患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），2组患者血清IL-2水平均较正常组下降，血清IL-6、IFN-γ水平均较正常组升高（P＜0.05）。治疗后，2组患者血清IL-2水平均较治疗前升高（P＜0.05），血清IL-6、IFN-γ水平均较治疗前下降（P＜0.05）；组间比较，2组患者对血清IL-2表达水平的升高作用无统计学差异（P＞0.05）；而对血清IL-6、IFN-γ表达水平的降低作用治疗组优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.7 2组患者治疗前后血清和尿液B7-1表达水平比较表6结果显示：治疗前，2组患者血清和尿B7-1表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），均较正常组水平明显升高（P＜0.05）。治疗后，2组患者血清和尿B7-1表达水平均较治疗前下降（P＜0.05），但治疗后2组患者的表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表5 2组患者治疗前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比较Table 5 Comparison of serum IL-2，IL-6，and IFN-γ levels in the two groups before and after treatment（）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与治疗前比较；③P＜0.05，与对照组治疗后比较

组别正常组对照组治疗组治疗后—19.81±2.13②13.87± 2.54②③N 20 27 28 IL-2[ρ∕（ng·mL-1）]治疗前5.88±0.62 2.32±0.22①2.16±0.21①治疗后—3.23±0.10②4.66±0.31②IL-6[ρ∕（pg·mL-1）]治疗前101.85±40.25 196.32±36.89①200.54±37.98①治疗后—162.41±39.56②122.65± 36.29②③IFN-γ[ρ∕（pg·mL-1）]治疗前12.54±1.85 24.56±3.51①25.89±2.98①

表6 2组患者治疗前后血清和尿液B7-1表达水平比较Table 6 Comparison of serum and urine B7-1 levels in the two groups before and after treatment （）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与治疗前比较

组别N正常组对照组治疗组治疗后—15.38±5.41②14.11±5.03②20 27 28血清B7-1[ρ∕（ng·mL-1）]治疗前4.34±0.35 20.41±7.35①21.13±6.96①治疗后—14.26±5.28②13.19±6.42②尿液B7-1[ρ∕（ng·L-1）]治疗前12.88±3.21 18.66±4.55①18.72±4.36①

3 讨论

CGN在历代中医古籍中归属于“慢肾风”、“尿浊”、“水肿”、“腰痛”、“虚劳”等疾病范畴。CGN的病因病机虽然各医家观点有所不同，但主要归于脾肾亏虚。王亿平教授认为其病机属脾肾亏虚，先后天相互为用，一损俱损；如遇外邪侵袭，则症状加重；同时，患者大多有瘀血阻络的表现，故临床以健脾益肾为治疗大法，并以活血化瘀法贯穿治疗始终[17]。参地颗粒的基础方人参汤首载于《圣济总录纂要》一书中，功效为健脾益肾、固摄精微。基于人参汤创制的参地颗粒除上述功效外，尚具有活血化瘀之力。方中红参补脾益肺、益肾助阳、固摄精微为君；茯苓、熟地黄健脾益肾，五味子养阴固精，桑螵蛸固精缩尿，鸡内金摄精止遗，共为臣药；川芎活血化瘀，为佐使之用，全方合用，共奏健脾益肾、固摄精微之功，又兼活血化瘀之效。

CGN的发病机理一直是临床及科研工作者研究的热点，病程中由于免疫反应的异常出现肾脏病理损伤得到广大肾脏病学者的认同，即体液免疫与细胞免疫在肾脏病中交相作用。本研究通过检测血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平发现，CGN患者确实存在细胞因子紊乱。由Th细胞分泌的IL-2在机体免疫应答过程中起关键作用。本研究中患者血清IL-2水平明显降低，通过治疗后有所升高，说明参地颗粒可以通过刺激IL-2分泌保护肾脏，与既往研究结果相似[18]。IL-6是加速肾小球疾病的重要因子，发生系膜增生性肾小球肾炎时，在沉积的免疫复合物刺激作用下可分泌IL-6，其作为病理性细胞因子又可反过来刺激系膜增生、系膜基质增多，加速肾脏病理恶化，因此，IL-6是与肾脏病变联系最为紧密的细胞因子之一[19]。IFN-γ属于典型的Th1细胞因子，其来源广泛，CD4＋T细胞、自然杀伤（NK）细胞均可分泌，主要参与细胞免疫。发生自身免疫性疾病时可刺激CD4＋T细胞表达IL-2、IL-12等因子，导致Th1∕Th2细胞比例失衡。目前已经证实IFN-γ与系统性红斑狼疮、IgA肾病等有关[20]。本研究结果表明，经过治疗后患者血清IFN-γ水平明显下降，与既往研究结果相似。因此，IFN-γ可通过刺激系膜细胞增生对肾脏血流动力学产生影响，使血浆蛋白等大分子物质通透性增加，从而加速肾脏病理变化。由此可见，CGN患者普遍存在Th1∕Th2细胞因子的失衡，IL-2、IFN-γ、IL-6不仅是免疫应答时产生的免疫介质，又可加速肾脏病理进程。

自身免疫性疾病的发生主要是由于机体内抗原抗体反应产生的免疫复合物沉积造成的炎症性反应，其中免疫细胞的异常活化是引起发病的基础。在活化的T细胞表面可见细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）的表达，与CD28竞争性结合B7（B7-1、B7-2）产生不同的生物学效应。CD28与B7结合后可促进T细胞活化，CTLA-4（CD152）与B7结合后发挥抑制性作用，机体内正常的功能活动是先由CD28提供共刺激信号促进T细胞活化，然后CTLA-4激活并竞争性结合B7分子下调免疫反应，抑制T细胞的过度激活[21]。实验研究表明[22]，敲除实验大鼠CTLA-4基因后会出现自身免疫疾病，因此推测CTLA-4∕B7在机体免疫调节方面占有重要的作用，如出现平衡紊乱则易引起疾病的发生。B7-1（CD80）表达于B细胞表面，是CD28∕CTLA-4的共同受体，可在肾脏足突细胞上表达[23]，但正常肾脏上无表达，持续炎症、缺氧的状态体内B7-1会上调，这与本研究结果一致，即治疗组和对照组患者血清及尿液B7-1的表达均较正常组明显增多，但经治疗后均下调。其引起蛋白尿的机制可能是影响肾小球滤过屏障，而敲除大鼠B7-1基因后则未发生蛋白尿。此外，CTLA-4∕B7与Th细胞密切相关，Th前体细胞（Th0）分化为Th1细胞这一过程需要B7-1的参与，从而促进IL-2、IFN-γ等表达，因此共刺激分子可通过干扰Th1∕Th2因子紊乱，调节肾脏病的进展。本研究结果表明，参地颗粒对于脾肾亏虚型CGN患者的中医证候积分、临床症状及24hUPr水平均有一定的改善作用，这可能是参地颗粒通过调节CTLA-4∕B7-1信号系统，抑制炎症因子的异常分泌，减轻免疫复合物的沉积而发挥作用，具体的作用机制有待进一步深入研究。