青藏高原高寒草甸有毒植物对土壤理化性质和土壤微生物丰度的影响

马建国，侯扶江，Saman BOWATTE

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

青藏高原作为全球海拔最高、面积最大的陆地生态系统[1]，面临着草地退化的严峻考验[2]，造成这一结果的原因有全球变化、人类干扰以及过度放牧。据调查，青藏高原90%的草地已经开始退化，其中35%的草地严重退化成只有有毒植物覆盖的“黑土滩”[3]。能够直接或间接危害人和动物的植物通常被称为有毒植物[4]。造成草地退化的因素中过度放牧被认为是主要因素，草地退化最终将导致物种多样性丧失和群落功能退化，有毒植物逐渐演替成为优势物种[5-6]。有毒植物的扩张会导致优良牧草的产量和品质下降，草畜矛盾不断激化，严重制约了牧区经济发展，已成为草地生态系统恢复、牧区经济和环境保护等工作的严峻问题[7]。因此，研究草地有毒植物具有重要意义。

有毒植物作为草地逆向演替的产物，能够忍耐并适应恶劣的生长环境，防止草地沙化和草地生态环境走向崩溃，但有毒植物的扩张所带来的损失也不容忽视[8]。早在20 世纪60 年代任继周[9]已经发现瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)、醉马草(Achnatherum inebrians)等有毒植物对家畜具有毒害作用，并针对不同有毒植物提出不同的防治措施。1998 年，美国农业部成立了有毒植物研究实验室，开展了一系列化感研究[10]。近年来关于有毒植物的研究日益增多，在调查青藏高原北部退化草地中有毒植物和优良牧草种群丰度空间和气候格局的关系时，Wu 等[11]发现降水是影响有毒植物和优良牧草比例的主要气候因素。也有报道称，气温不断升高以及越来越长的生长季也会加剧有毒植物的扩张[12]。王迎新等[13]围绕草地农业生态系统四个生产层论述了有毒植物在草地生态系统中的作用，认为有毒植物的扩张是草地退化的标志。然而，有毒植物的合理利用能提高牧区经济效益和生态效益。在有毒植物的防控与利用上有学者提出了不同的方法，如人工拔除、使用除草剂等化学方法灭除、竞争种代替控制、生物防治和新药物开发等[8]。

虽然已经有许多关于有毒植物的研究[4-5,8,11]，但是关于有毒植物对地下过程影响的研究却很少。植物会影响地下微生物群落、养分有效性(土壤C、N 等)、有机质矿化、碳封存、土壤温室气体排放等[14]，当草地中有毒植物的比例发生变化时，地下环境状况也会随之改变。这将对草地生产力和植物群落多样性产生重大影响。瑞香狼毒是一种常见的家畜不喜食的有毒植物，在青藏高原高寒草甸上大量入侵。Sun 等[15]研究瑞香狼毒的传播引起的土壤养分、碳氮库大小和周转率的变化，发现，瑞香狼毒斑块形成了肥力岛(即更高的土壤养分有效性)，从而促进了其在高寒草甸内的扩张。是否所有有毒植物都显示出类似的效果，或者它们对土壤的影响是否在不同的有毒植物之间有所不同？这一重要疑问还没有得到检验，因此，本研究假设，不同有毒植物的地下效应存在差异，并且这些影响也不同于无毒的适口植物。为了验证假设，本研究选取青藏高原中最主要的5 种有毒植物甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis)、瑞香狼毒、披针叶黄华(Thermopsis lanceolata)、麻花艽(Gentiana straminea)、黄帚橐吾(Ligularia virgaurea)[16]和一种适口性优势种多年生草本植物垂穗披碱草(Elymus nutans)，比较它们对地下环境的影响。

1 材料与方法

1.1 研究样地概况

本研究在甘肃省甘南州玛曲县阿孜畜牧科技示范园区天然草地进行，该示范园区位于青藏高原东北部(33°36'40'' N，102°44'50'' E)，海拔3 550 m，年平均气温为1.4 ℃，年降水量为650 mm[17]。放牧家畜为牦牛，草地类型为典型高寒草甸，土壤类型为亚高山草甸土。由于长期超载过牧，样地有毒植物滋生，主要包括黄帚橐吾、披针叶黄华、甘肃棘豆、瑞香狼毒以及龙胆科植物，适口性好的优质牧草主要有垂穗披碱草、禾叶嵩草(Kobresia graminifolia)、草地早熟禾(Poa annua)、洽草(Koeleria macrantha)、波伐早熟禾(P. poophagorum)等[17]。

1.2 样品采集

2018 年8 月下旬，在该示范区天然草地上随机选择6 个区域，在每个区域内同一种植物生长密集(盖度 ＞ 90%)的地方进行取样，所选植物如表1所列[17]。齐地剪掉地上部分，分别用根钻(直径15 cm)取10 cm 深的土壤，在 24 h 内，用2 mm 土筛去除土壤样品中的植物残体、石头等，分装成两份样品，一份 -20 ℃保存用于土壤微生物分析，另一份4 ℃保存用于土壤理化性质的测定。

表 1 5 种有毒和1 种无毒植物特征Table 1 Details of five toxic and one non-toxic plant species used in this experiment

1.3 土壤理化性质测定

采用烘干法测定土壤水分，将土壤样品置于铝盒内在105 ℃的电热鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海精宏)中烘干至恒重(约48 h)。用pH 计(PE-10，Sartorious, Germany)测定土壤pH (土∶水 = 1∶5)。使 用 元 素 分 析 仪(Vario EL / micro cube, Elementar,Hanau, Germany)测定土壤全碳(total carbon, TC)和全氮(total nitrogen, TN)。

1.4 土壤微生物指标测定1.4.1 土壤微生物量碳测定

土壤微生 物生物量碳(microbial biomass carbon,MBC)的测定采用熏蒸-氯仿提取方法[18]。

1.4.2 土壤微生物DNA 提取

使 用FastDNA® spin kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)试剂盒提取土壤中的总DNA，将提取的样品DNA 保存在 -20 ℃冰箱中备用。

1.4.3 土壤细菌、真菌和氮循环细菌的定量

使用CFX96 光学实时检测系统(CFX96TM Thermal Cycler, USA)进行实时定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)测定每个样品的DNA，每个样品3 个重复，来分析土壤细菌、真菌和氮循环细菌的基因拷贝数。土壤细菌、真菌基因拷贝数分别通过定量16S rDNA 和18S rDNA 扩增数量确定。通过标靶amoA 基因来研究氨氧化细菌(ammoniaoxidizing bacteria, AOB)，标靶nirS 基因研究亚硝酸还原菌，标靶nosZ 基因研究氧化亚氮还原菌3 个氮循环关键细菌基因丰度。qPCR 反应混合物(20 μL)，其中包含10 μL TB Green Premix Ex Taq (TaKaRa Biotech,大连，中国)，正向与反向引物各0.25 μL 和1.0 μL 土壤DNA 模板，之后使用灭菌的超纯水补充到20 μL。利用克隆技术获得微生物标靶基因的重组质粒，然后以10 倍梯度稀释质粒浓度用于qPCR的标准曲线。引物和热循环条件如表2 所列。

1.5 数据统计分析

所有数据均采用Microsoft Excel 2010 输入并整理，用SPSS 20.0 软件进行数据的单因素方差分析，显著水平P＜0.05 的用Origin 2017 软件作图，对基因丰度数据进行对数转换以满足正态分布要求。采用主成分分析法(Canoco 5.0)研究了有毒植物与土壤参数之间的相关性。

表 2 引物信息及反应条件Table 2 qPCR primer details and thermal conditions

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质比较

对有毒和无毒植物的土壤特性进行分析(图1)，结果表明，除土壤pH、C/N 以外，有毒植物对土壤理化性质有显著影响，且不同有毒植物对土壤理化性质的影响存在差异。有毒植物的平均土壤含水量普遍高于无毒植物垂穗披碱草，但只有甘肃棘豆和披针叶黄华与其差异显著(P＜0.05)。除麻花艽以外，所有有毒植物的土壤TC 显著高于无毒植物垂穗披碱草(P＜0.05)，且在有毒植物中，狼毒的土壤TC 显著高于披针叶黄华、麻花艽和黄帚橐吾(P＜0.05)。除麻花艽以外，有毒植物的土壤TN 显著高于无毒植物垂穗披碱草(P＜0.05)。除麻花艽以外，所有有毒植物的土壤MBC显著高于无毒植物垂穗披碱草(P＜0.05)，且有毒植物中MBC 最高的是甘肃棘豆，其次是瑞香狼毒，最低的是麻花艽。

图 1 有毒和无毒植物对土壤特性的影响Figure 1 Effects of toxic and non-toxic plants on soil properties

2.2 土壤微生物丰度比较

对有毒和无毒植物的土壤微生物基因丰度进行分析(图2)，结果显示，植物类型对土壤细菌、硝化细菌和反硝化细菌有显著影响，但对真菌的影响不显著(P ＞ 0.05)。有毒植物的平均细菌丰度低于无毒植物垂穗披碱草，但只与狼毒、披针叶黄华和麻花艽差异显著(P＜0.05)，且有毒植物物种之间差异不显著(P ＞ 0.05)；所有有毒植物的土壤硝化细菌丰度显著低于无毒植物垂穗披碱草(P ＜0.05)，且有毒植物中黄帚橐吾的AOB 基因丰度高于其他有毒植物。狼毒的土壤nirS 基因显著低于垂穗披碱草、甘肃棘豆和黄帚橐吾(P＜0.05)。植物类型对土壤nosZ 基因丰度有显著影响(P ＜0.05)。

图 2 有毒和无毒植物对土壤微生物基因丰度影响Figure 2 Effects of toxic and non-toxic plants on soil microbial gene abundance

2.3 土壤特性与植物相关性

4 种有毒植物(甘肃棘豆、披针叶黄华、瑞香狼毒、黄帚橐吾)与土壤理化性质正相关，但与土壤微生物负相关；相反，无毒植物垂穗披碱草与土壤微生物正相关，与土壤理化性质负相关(图3)。

3 讨论

本研究发现，有毒植物(除麻花艽)对青藏高原高寒草甸土壤特性有显著影响，且不同于无毒植物垂穗披碱草，同时不同有毒植物对土壤特性的影响也存在差异。而毒性最低的麻花艽对土壤特性的影响与无毒植物垂穗披碱草相似。王文颖等[24]发现，高寒矮嵩草草甸麻花艽对土壤特性影响小，可能是麻花艽根际分泌物作用小，且其生长对养分需求小的共同作用。有毒植物能够提高土壤养分，这一研究结果与Sun 等[15]对青藏高原高寒草甸不同地形瑞香狼毒对土壤养分影响的结果一致。但吴天马等[25]分析云南、四川紫茎泽兰(Ageratina adenophora)对土壤特性的影响，结果发现其显著降低了土壤碳、氮、磷等养分，这可能与植物的生长节律有关。

有毒植物(除麻花艽)土壤TC、TN 都明显高于无毒植物垂穗披碱草，这是由于动物选择性采食垂穗披碱草等优良牧草，减少有毒植物因动物采食而造成的组织损失。同时，有毒植物的扩张导致返还到土壤中的枯落物产量增加[26]，这与瑞香狼毒[15]和入侵种绿毛山柳菊(Hieracium pilosella)[27]的研究结果相似。豆科植物(甘肃棘豆、披针叶黄华)具有很强的生物固氮能力，可预测随这两种有毒植物的扩张，将有更高的氮在土壤中得到积累。通常情况下，不同植物根际释放的化学物质具有特异性，致使植物类型对土壤pH 的影响不同[28]。我们假设这种现象在有毒植物中也会发生，因为已知有毒植物在根际释放的化学物质不同[29-30]。但本研究中植物类型对土壤pH 无影响。安冬云等[31]对瑞香狼毒发生区与未发生区土壤特性差异的研究中，发现其对土壤pH 影响不显著。除麻花艽外，有毒植物显著提高土壤MBC，但本研究发现有毒植物降低细菌丰度，对真菌无影响。一般认为，细菌和真菌的丰度与土壤MBC 显著相关[32]。这可能是存在有适应有毒植物根境的特殊小动物，在测定MBC 时被熏蒸杀死，造成MBC 结果偏高。

图 3 植物与土壤理化性质和微生物丰度相关性分析Figure 3 Correlation analysis of plant and soil physicochemical properties and microbial abundance

不同植物根系分泌不同的化学物质，对土壤微生物影响也不同。已有研究表明，有毒植物可以通过改变土壤中原有的微生物结构而实现扩张，同时有毒植物入侵改变了凋落物的结构也将影响参与枯落物分解的细菌。也有研究表明，瑞香狼毒的扩张降低了多酚氧化酶[33]。此外，无毒植物垂穗披碱草建植可以提高土壤细菌丰度[34]，这就能解释本研究中发现的有毒植物降低了土壤微生物细菌丰度。一方面是因为有毒植物形成了只适合自身生长的细菌群落，另一方面是因为无毒植物垂穗披碱草枯落物中含有大量难分解物质(如纤维)，需要大量的细菌参与分解。相同的结果在杂草五爪金龙(Ipomoea cairica)入侵地得到验证[35]。本研究发现，有毒植物能降低土壤氮循环细菌丰度。AOB 作为硝化作用的限速步骤，参与氨转化成亚硝酸盐反应，控制着整个硝化作用速率，当植物和土壤微生物消耗硝酸盐的速率小于硝化反应速率，将导致氮的净流失。有研究表明，一些非洲草种能够限制土壤中的硝化作用来防止氮的流失[36]，本研究5 种有毒植物均降低了土壤AOB 基因丰度，这种限制土壤硝化作用的方式将减少有毒植物扩张区土壤中氮的净流失，增加土壤有效氮含量，从而促进有毒植物自身生长[37]，同时有毒植物的这一机制将防止水体富营养化、减少N2O的排放。同样的结果在紫菀(Aster tataricus)入侵欧洲和美国时候也得到验证[38]。不过，关于扩张入侵种对土壤AOB 基因影响结果不一，也有学者发现大麦状雀麦(Bromus hordeaceus)在改变入侵地土壤AOB 群落结构的同时增加了AOB 丰度[39]。造成这种结果不一的原因可能是不同植物在不同生长地表现出不同的适应机制。因此，如果能平衡放牧和有毒植物之间的关系，不仅能解决放牧和有毒植物扩张的对立矛盾，还能收获生态环境效益。PCA 清楚地表明土壤特性与有毒植物呈正相关关系，并且微生物与有毒植物呈负相关关系，而无毒植物正好相反。这说明本研究选取的几种有毒植物在该地区竞争趋于稳定，形成了一套完整的养分竞争模式。

有毒植物本属于草地固有植被，其扩张是由草地严重超载，环境走向边缘导致的。这种现象虽然阻碍了牧区畜牧业发展和生态环境保护等工作，但本研究认为有毒植物在草地养分固定，防止氮流失等功能上优于无毒植物，这一机制有利于保护水质、减少N2O 温室气体的排放，提高退化草地植被多样性和生产力。

4 结论

本研究发现有毒植物能明显改变青藏高原高寒草甸地下环境，如提高土壤养分含量(TC、TN、MBC)，降低土壤氮循环细菌丰度，这一机制表明平衡植物群落中有毒植物的比例具有重要意义。未来关于有毒植物的研究可以控制模拟不同比例下有毒植物对土壤和无毒植物的影响，探究有毒植物的扩张机制，针对不同的有毒植物提出不同的防控与利用措施。