壳聚糖基纳米氧化锌—丁香精油抗菌复合膜对鲜肉保鲜效果

方丹丹 - 王利强,2 -,2

(1. 江南大学机械工程学院，江苏 无锡 214122；2. 江苏省食品先进制造装备技术重点实验室，江苏 无锡 214122)

抗菌食品包装是一种基于在食品包装材料中加入抗菌物质以控制食物质量的不良变化的新型活性包装形式。随着人们安全意识和环保意识的增强，制备出可降解、绿色环保以及具备对细菌高度敏感的生物质材料已成为食品及包装行业的研究热点。

壳聚糖(chitosan)为甲壳素N-脱乙酰化产物，是一种具有生物相容性、生物降解性和抗菌性的良好材料，对很多细菌具有抑制作用[1]。由于其机械和阻隔性能，限制了其在食品包装中的应用，而与其他高分子材料复合是改善其性能的方法之一[2]。魔芋葡甘聚糖是由D-葡萄糖和D-甘露糖两种多糖连接起来的大分子杂多糖，可直接溶解成为无色透明的溶液或是凝胶，用其制备的薄膜具有工艺简单、价格低廉、可热封的优点，具有很好的生物相容性及可降解性，可广泛应用于食品保鲜[3]。壳聚糖和魔芋葡甘聚糖是两种带有相反电荷的聚电解质，可形成聚电解质复合物，利用两种材料的互补性制备的复合材料具有更好的力学性能和阻隔性能[4]。

纳米氧化锌(1～100 nm)具有粒子尺寸小，比表面积大等特点。通过超声分散作用，纳米氧化锌在基材中具有很强的纳米分散能力，且与基材界面的相互作用很强[5]。根据美国食品和药物管理局的协议(21CFR182.8991)，氧化锌是公认的安全(GRAS)材料[6]。纳米氧化锌作为抗菌剂使用，对微生物具有很强的抑制作用，并与人体细胞保持良好的生物相容性[7]。这种无机抗菌剂能有效弥补壳聚糖膜性能的缺陷[2]，能强化其抗菌作用、机械性能。为了使复合膜的抑菌程度达到高度敏感或是极度敏感的程度，引入新的抗菌剂丁香精油。丁香精油为天然植物抗菌剂，在体外对不同的食源性病原体如大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、肠炎沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌等显示出优异的抗微生物活性[8]。

试验拟以壳聚糖和魔芋葡甘聚糖为成膜基质，甘油为增塑剂，纳米氧化锌和丁香精油为抗菌剂，通过流延成膜法制备抗菌复合膜，并将复合膜用于鲜肉的保鲜试验，以鲜肉色差、pH、菌落总数、挥发性盐基氮为指标来评估复合膜的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜猪肉：市售；

壳聚糖：脱乙酰度80%～95%，国药集团化学药剂有限公司；

魔芋葡甘聚糖：分析纯，合肥博美生物科技有限公司；

甘油、丁香精油：分析纯，国药集团化学药剂有限公司；

纳米氧化锌：粒度50 nm，分析纯，阿拉丁试剂；

大肠杆菌菌种：CMCC(B)44102，上海鲁微科技有限公司；

金黄色葡萄球菌菌种：CMCC(B)26003，上海鲁微科技有限公司。

1.2 仪器与设备

数字显示转速电动搅拌机：JB200-S型，上海标本模型厂；

立式压力蒸气灭菌器：LDZM型，上海申安医疗器械厂；

垂直层流洁净工作台：HCB-1300V型，青岛海尔特种电器有限公司；

色彩色差计：CR-400/410型，柯尼卡美能达。

1.3 试验方法

1.3.1 抗菌复合膜的制备

(1) 壳聚糖膜液的制备：称取一定量的壳聚糖粉末倒入体积分数1%乙酸溶液中，配制成质量分数1%壳聚糖溶液，60 ℃搅拌1 h充分溶解。

(2) 魔芋葡甘聚糖膜液的制备：称取质量分数0.5%魔芋葡甘聚糖倒入60 ℃水中，搅拌5 min，60 ℃水浴2 h。

(3) 抗菌复合膜的制备：将魔芋葡甘聚糖膜液60 ℃水浴使其从凝胶状变为溶液状态，与壳聚糖膜液进行共混，加入质量分数25%甘油，制备成混合膜液。称取6%(相对于壳聚糖和魔芋葡甘聚糖干重的质量分数)纳米氧化锌溶于去离子水中，使用超声细胞分散机将其分散在水溶液中，再添加到混合膜液中。加入质量分数0.2%吐温80搅拌1 h，再分别加入体积分数0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%丁香精油，定容至300 mL，再次搅拌1 h，10 000 r/min均质5 min，将配置好的溶液倒在干净的有机玻璃板上，烘干。冷却揭膜，保存备用。

1.3.2 抗菌性能的测定 根据GB/T 31402—2015对复合膜的抑菌性能进行表征。其中，覆盖膜采用PE膜，空白膜为未加抗菌剂的薄膜，抗菌膜为添加质量分数6%纳米氧化锌和不同浓度丁香精油的复合抗菌膜。将覆盖膜和试样样品放入无菌自封袋中，加入20 mL洗脱液，用手充分揉搓袋中试验样品和覆盖薄膜，将细菌洗下，充分摇匀后，吸取1 mL菌液，稀释成10-1，10-2，…，10-5，分别取0.1 mL接种于平板计数琼脂培养基中，(37±1) ℃下培养24～48 h，按GB/T 4789.2—2016的方法测定菌落数，每个样品平行3次。按式(1)计算抑菌率。

(1)

式中：

R——抑菌率，%；

B——PE膜每平皿平均回收菌落数，CFU；

C——抗菌膜每平皿平均回收菌落数，CFU。

1.3.3 红外光谱分析 使用傅立叶变换红外光谱仪对复合薄膜进行红外光谱表征，扫描范围4 000～500 cm-1。

1.3.4 微观结构分析 采用扫描电镜在不同放大倍数下观察膜微观结构，直至出现清晰图片为止，抓取图片并进行分析。

1.3.5 鲜肉保鲜试验

(1) 肉样处理：将抗菌膜、PE膜、案板和刀具使用95%酒精擦拭后，于超净台进行紫外灭菌(30 min)。将新鲜肉样切割成10 g长方形，分别用PE膜(对照)空白膜、抗菌复合膜将其裹包，将3个肉样放入同一托盘中，用保鲜膜封好。其中，空白膜(CL-0)为不添加抗菌剂薄膜，抗菌复合膜为添加质量分数6%纳米氧化锌和体积分数0.6% 丁香精油的复合膜(CL-6)。将包装好的肉样置于4 ℃ 冰箱中，分别在第0，2，4，6，8，10，12，14天测定样品色差、pH、菌落总数、挥发性盐基氮等指标。

(2) 色差测定：使用色差仪对肉样L*值、a*值和b*值进行测定，每组样品测试5次。

(3) pH测定：按照GB 9695.5—2008进行测定。

(4) 菌落总数测定：按照GB 4789.2—2010进行测定。

(5) 挥发性盐基氮(TVB-N)测定：按照GB 5009.228—2016，采用微量扩散法进行测定。

1.4 数据处理

采用Origin 8对试验数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 复合膜的抑菌试验

当抑菌率>90%时，复合膜具有抑菌作用；当抑菌率>99%时，复合膜具有强抑菌效果。由表1可知，添加纳米氧化锌和丁香精油后菌落数明显减少，两者结合后的抗菌效果更佳。菌落数随丁香精油添加量的增加而减少，抗菌效果越明显，对两种细菌均具备较好的效果。空白膜为壳聚糖—魔芋葡甘聚糖复合膜，该复合膜对目标菌种抑菌率分别为82.68%，82.18%，抗菌作用力较弱。添加质量分数6%纳米氧化锌和体积分数0.2%丁香精油的复合膜，对目标菌种抑菌率为90.24%，91.23%；当丁香精油添加量为0.6%时，该复合膜对目标菌种抑菌率分别为99.78%，99.06%，具有强抗菌作用。这是因为丁香精油中含有丁香酚，其中酚反应性基团和壳聚糖的官能团以及纳米氧化锌与细菌细胞膜有相互作用，在抑制微生物的生长中起着至关重要的作用[9]，且纳米氧化锌和丁香精油在抗菌方面会产生协同作用。故丁香精油体积分数为0.6%～0.8%较为合适。

表1复合包装膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率

Table 1 Antibacterial rate of composite packaging film of different content of clove oil toStaphylococcusaureusandEscherichiacoli%

样品金黄色葡萄球菌大肠杆菌PE膜0.000.00空白膜82.1882.680.2%丁香精油91.2390.240.4%丁香精油97.5896.110.6%丁香精油99.0699.780.8%丁香精油99.7399.821.0%丁香精油99.9999.98

2.2 红外光谱分析

由图1可知，3 387 cm-1处为壳聚糖与魔芋葡甘聚糖分子之间的氢键作用以及壳聚糖的氨基伸缩振动吸收重叠形成的峰；2 897，1 555 cm-1处分别对应于CH2振动和H2O弯曲模式，1 404，1 021 cm-1处代表CH2弯曲振动；681 cm-1处为氧化锌拉伸模式形成的峰。当在基质中分别掺入体积分数0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%丁香精油时，其中与O—H振动键合的N—H键向较低频率移动，分别从3 387 cm-1到3 360，3 323，3 342，3 336，3 307 cm-1，一方面是由于壳聚糖中的氨基与氧化锌之间发生反应，另一方面是壳聚糖官能团与丁香精油中存在的酚反应性基团发生了键合[9]。

图1 复合膜红外光谱图

Figure 1 Infrared spectrum of different content of clove oil composite film

2.3 微观结构分析

由图2可知，掺入丁香精油和氧化锌的薄膜中，表面结构粗糙度比空白膜的明显。粗糙度的增加可能是由于氧化锌以及整个膜基质中的丁香精油液滴的分布，与体积分数0.6%丁香精油结合的壳聚糖—魔芋葡甘聚糖薄膜显示出油相和基材相之间的相分离。丁香精油在基材表面观察到其形状像空心腔，是由于纳米复合膜中存在的丁香精油的疏水性导致的，高含量低密度的丁香精油可定位在薄膜的上表面，从而形成微囊结构。具有疏水性质的丁香精油保留并定位在基质内，能阻碍水分子通过薄膜转移，表明丁香精油可防止水分吸附，有助于降低薄膜的水蒸气透过率[10]。在与精油结合的壳聚糖—魔芋葡甘聚糖薄膜中观察到纳米氧化锌的分散性增强的现象，其在机制中均匀分布，未出现团聚现象，有利于维持复合膜结构，可能是由于纳米粒子可以有效地吸附在油与水之间的界面上。

图2 6%纳米氧化锌复合膜的微观结构

2.4 鲜肉保鲜试验

2.4.1 色差 由表2可知，对照组在贮藏期间的L*值、a*值均低于CL-0、CL-6组的，b*值均显著高于CL-0、CL-6组的。对照组L*值随贮藏时间的增加而降低，甚至更加明显，由于光的扩散减少，使肉表面过量的水蒸发导致颜色变暗。对照组a*值的显著变化可能是由于脂质氧化和微生物腐败作用。贮藏过程中乳酸菌产生的过氧化氢积累，导致肉制品颜色变化[11]。CL-6组样品显示出较低的颜色值变化，是因为添加纳米氧化锌和丁香精油的复合膜具有强的抗氧化和抗微生物性质。结果表明，将纳米氧化锌和植物精油掺入壳聚糖—魔芋葡甘聚糖膜中可以增强膜的抗氧化和抗菌性能，从而保持鲜肉样品的质量。

表2 鲜肉色差随贮藏时间的变化

2.4.2 pH 由图3可知，鲜肉初始pH为5.81，主要是由糖原基被分解为乳酸造成的，与Hu等[12]报道的5.97相当接近；贮藏至第8天时，对照组pH逐渐增加至7，可能是由于需氧细菌的增殖所致；将CL-0、CL-6抗菌膜应用于猪肉表面时，可显著降低pH的增加速度，尤其是CL-6膜对pH值的增加速度影响更为显著。对照组第4天pH达6.56，为次鲜肉，CL-0组第8天pH为6.32，为次鲜肉；经CL-6复合膜处理过的样品的pH在0～8 d略微增加，第12天pH为6.27(变为次鲜肉)，pH增加幅度变大。基于纳米氧化锌和丁香精油的膜的抗微生物效力可解释包裹样品的较低pH。

图3 鲜肉pH值随贮藏时间的变化

2.4.3 菌落总数 由图4可知，鲜肉初始菌落总数为3.7 lg CFU/g，表明肉中存在微生物，可能是在切片制备或是包装等过程中被污染。贮藏0～4 d，对照组(PE膜包装)菌落总数急剧增加，且第4天时超过6 lg CFU/g(鲜肉的可接受上限)，已开始腐败变质；CL-0组菌落总数略低于对照组，对细菌生长有一定抑制作用，贮藏至第4天时细菌总数为4.27 lg CFU/g，为次鲜肉；CL-6组贮藏至第6天时仍处于新鲜肉范围内，第8～14天为次鲜肉(第14天时细菌总数为5.35 lg CFU/g)，较空白组延长保鲜6～8 d。因此，纳米氧化锌和丁香精油可显著抑制食物腐败微生物的生长，保持肉质质量。

图4 鲜肉菌落总数随贮藏时间的变化

Figure 4 The logarithm of the total number of colonies of the meat sample varies with storage time

2.4.4 挥发性盐基氮(TVB-N) 由图5可知，CL-6组TVB-N值在贮藏期间含量较低。贮藏过程中，所有样品TVB-N值持续增加，但添加纳米氧化锌和丁香精油的复合膜的增长速率最小，归因于细菌群体数量的快速减少或细菌对非蛋白质氮化合物的氧化脱氧能力的降低或两者的氧化脱氨能力的降低[13]。空白组贮藏至第2天时TVB-N值为18.2 mg/100 g，为次鲜肉，第4天为22.4 mg/100 g，已腐败变质。CL-0组贮藏至第4天时TVB-N值为16.6 mg/100 g，第8天为20.1 mg/100 g，已腐败变质。CL-6组贮藏至第14天时TVB-N值为23.5 mg/100 g，较对照组和空白组，可延长保鲜6～8 d，表明CL-6膜中组分具有减少蛋白质分解及含氮物质释放的作用。故添加纳米氧化锌和丁香精油的抗菌薄膜具有优异的耐腐性，可延长鲜肉保质期。

图5 肉样的挥发性盐基氮含量随贮藏时间的变化

Figure 5 Total number of TVB-N value of meat samples

3 结论

将纳米氧化锌和丁香精油作为抗菌剂，添加至壳聚糖—魔芋葡甘聚糖基膜中，通过流延法制备抗菌复合膜。当丁香精油浓度达0.6%(体积分数)时，制备的复合膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌作用，表明丁香精油和纳米氧化锌在抗菌方面具有很好的协同作用。在鲜肉保鲜试验中，综合各指标发现，PE膜对鲜肉的保质期为4 d左右，无抗菌剂的空白复合膜保质期为6～8 d，添加质量分数6%纳米氧化锌和体积分数0.6%丁香精油的复合膜的鲜肉保质期超过14 d，该抗菌膜可提高鲜肉保质期6～8 d，可有效用于鲜肉保鲜。试验以丁香精油为抗菌剂添加到复合膜中，达到了很好的抗菌效果，但丁香精油本身具有挥发性，需进行模拟试验以确定其释放规律。