3 种不同品种沙棘叶中没食子酸含量的测定

张 欣，张雪娟，王小莉，郭海利，姚 莹，张小民

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名黑刺、醋柳、酸刺等，属于蔷薇目胡颓子科沙棘属，落叶灌乔木。在我国，沙棘主要分布于山西、陕西、甘肃、青海、内蒙古、河北等地[1]。据报道[2]，沙棘属植物有7 个种11 个亚种，而我国含有7 个种（柳叶沙棘、沙棘、肋果沙棘、棱果沙棘、西藏沙棘、理塘沙棘、江孜沙棘）和7 个亚种（云南沙棘亚种、卧龙沙棘亚种、蒙古沙棘亚种、中亚沙棘亚种、中国沙棘亚种、江孜沙棘亚种、密毛肋果沙棘亚种）。山西省分布的野生沙棘全部为中国沙棘[3]，2011 年水利部在太谷县设立了沙棘新品种试验基地种植沙棘新品种，阜杂1 号和杂优54 号于2012 年引自水利部鄂尔多斯沙棘种植基地。近年来，对沙棘的研究主要集中在沙棘结构[4-5]和沙棘果油籽油的开发[6-7]，对沙棘叶的研究较少，沙棘中多酚类化合物主要以没食子酸为母核[8]。没食子酸又称五倍子酸，其化学名称为3，4，5- 三羟基苯甲酸，广泛存在于各种植物中，是化学结构最简单的天然多酚类化合物[9]。没食子酸具有保护心血管的作用，如抗高血压、抗心肌梗死、抗血管钙化；还具有保护神经系统、抗糖尿病和抗肝纤维化作用[9]。此外，没食子酸还对肿瘤细胞（如胰腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病、胃癌等）有杀伤作用[10-14]。因此，对没食子酸的研究具有广阔的应用前景。

沙棘多酚的测定方法多采用比色法，其准确度较低，且少有人测定没食子酸的含量。

本研究采用高效液相色谱法，测定比较了山西中国沙棘以及水利部推广的新品种沙棘阜杂1 号和杂优54 号的没食子酸含量，旨在为沙棘叶的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试沙棘品种为中国沙棘、阜杂1 号和杂优54 号，其中，中国沙棘为山西省野生品种；阜杂1号和杂优54 号种植于山西省太谷县任村乡郝村水利部沙棘新品种试验基地。

1.2 试验仪器与试剂

岛津高效液相色谱仪（LC-2030C3D）；昆山超声波清洗机（KQ-500DE）；超纯水机（密理博SimplicityUV）；电子分析天平（梅特勒XSE205DU）。

没食子酸标准品采自国家标准物质网（CAS149-91-7）；水为超纯水（超纯水机制备）；甲醇为高效液相色谱级；其他试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为AmethystC18-11（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶0.1%磷酸（15∶85）；柱温为30 ℃；流速为1.00 mL/min；检测波长为273 nm，进样量为20 μL。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 标准品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇，溶解稀释至刻度后摇匀，作为对照品溶液，溶液浓度为1.125 g/L，备用。

1.3.2.2 供试品溶液的制备 精密称取沙棘叶粉末1 g，置于50 mL 容量瓶中，加50 mL 甲醇溶解，超声提取1 h（功率500 W，频率40 kHz），待溶液冷却至室温后，甲醇补足减失的量，摇匀；用0.22 μm的有机微孔滤膜过滤，取滤液，即为供试样品。

2 结果与分析

2.1 没食子酸对照品的HPLC 分析

在1.3.1 色谱条件下测得没食子酸标准品的HPLC图如图1 所示，没食子酸出峰时间为6.290min。

2.2 线性关系的考察

精密吸取没食子酸对照品溶液5，10，15，20，30，40，60 μg/mL，在1.3.1 色谱条件下，注入高效液相色谱仪中，测定其峰值。以没食子酸的进样量（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得到回归线方程y＝41 165.3x-123 188（n＝7，R2＝0.998 1），结果如图2 所示，表明对照品没食子酸进样量为5～60 μg/mL 时，与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

在1.3.1 色谱条件下，取30 μg/mL 没食子酸标准溶液20 μL，连续进样5 次，结果测得没食子酸峰面积的RSD 为1.02%（n＝5），说明该仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

在1.3.1 色谱条件下，于0，2，4，8，12 h 测得没食子酸峰面积RSD 值为1.11%（n＝5），说明在12 h内没食子酸稳定性良好。

2.5 重复性试验

在1.3.1 色谱条件下，取6 份中国沙棘叶供试品，分别进样，测得没食子酸峰面积RSD 值为1.28%（n＝6），说明该方法重现性良好。

2.6 回收率试验

精密称取已知含量的供试品5 份，每份约0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，再分别精密加入0.5 mL 质量浓度为1.125 g/L 的没食子酸标准品，按照1.3.2.2方法制备5 份供试品溶液，在1.3.1 色谱条件下进行检测，测得结果如表1 所示，结果显示，回收率平均为97.42%，RSD 值为0.42%。说明该试验没食子酸的加标回收率符合要求。

表1 沙棘叶没食子酸回收率测定结果

2.7 样品含量测定

按照1.3.2.2 方法制得供试品，在1.3.1 色谱条件下测定不同品种沙棘叶中没食子酸的含量，由表2 可知，沙棘叶中没食子酸的含量由大到小依次为中国沙棘＞杂优54 号＞阜杂1 号。

表2 不同品种沙棘叶中没食子酸含量测定 mg/g

3 结论与讨论

本试验利用高效液相色谱仪测定不同品种的沙棘叶中没食子酸的含量。取沙棘叶粉末，用甲醇在超声波辅助下提取1 h，再经0.22 μm 的有机微孔滤膜过滤后，利用高效液相色谱法测定不同品种的沙棘叶中没食子酸的含量。结果表明，没食子酸的进样量为5～60 μg/mL 时与峰面积呈良好线性关系，且中国沙棘叶中的没食子酸含量最多，杂优54 号次之，阜杂1 号没食子酸含量最少。阜杂1 号和杂优54 号沙棘早熟，果大且多，色泽鲜艳，口感较好；中国沙棘虽然晚熟果的口感酸涩，但其叶的营养成分含量优于阜杂1 号和杂优54 号，二者在利用价值上各有利弊。牟丹等[15]采用比色法，以没食子酸为标准品测得青海地区沙棘叶中总多酚的含量为（15.34±1.88）mg/L，与本试验结果存在差异，可能是由于提取条件不同。敬思群[16]以没食子酸为标品，采取分光光度法测得沙棘叶中多酚提取液的吸光度为7.385 mg/g，所测含量比本试验结果高，可能是由于测定方法不同。

山西省的野生沙棘面积居于我国首位[17]，其资源丰富，开发利用前景广阔，目前我国对沙棘的开发利用主要为沙棘果和沙棘叶，其中，沙棘果的开发主要包括沙棘籽油、沙棘果油、沙棘汁等，沙棘叶的开发主要为沙棘茶[18]。根据前人的研究结果，沙棘叶中除了没食子酸外还含有大量芦丁以及科罗索酸[19-20]，且没食子酸对多种癌细胞都有抑制作用。周菲菲等[21]研究结果表明，增强Caspase-3 表达诱导卵巢癌SKOV3 细胞凋亡；罗强等[22]研究结果表明，没食子酸通过上调p53 基因表达、下调Bcl-2基因表达，诱导Hela 细胞凋亡；王莹等[10]研究认为，没食子酸可能通过线粒体信号传导途径诱导人胰腺癌MIA Paca-2 细胞凋亡；ISHIHARA 等[23]研究表明，没食子酸对人白血病细胞（HK-63）活性具有一定的抑制作用；没食子酸还被证实能降低人肺腺癌细胞（PC-14）和人胃腺癌细胞（MKN45）等人类癌细胞系的存活率[24]。沙棘叶中含有大量的没食子酸，表明其具有抗癌作用。沙棘在抗癌药的开发方面具有广阔前景。