UPLC-PDA法同时测定连翘中4种成分的含量

刘 芳，魏 娟,，张晓燕,，熊先明，祝 宇,，余世荣*

（1.十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院）药学部，湖北 十堰 442000；2.武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000；3.兵兵宏康中药饮片（十堰）有限公司；湖北 十堰 442510）

连翘是木犀科植物连翘Forsythia suspense(Thunb.) Vahl的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，按采收期的不同分为分青翘和老翘[1]。主要含苯乙醇苷类、黄酮类、木脂素类、萜类、挥发油类等化合物[2-5]。《中国药典》2015年版中规定以代表性的苯乙醇苷（连翘酯苷A）和木脂素类化合物（连翘苷）为连翘药材的质量评价指标。然而根据中药具有多成分、多靶点的特点，单一的成分很难全面反映连翘药材质量，采用多个指标性成分进行质量评价更具有科学性和全面性。

现代药理研究表明，槲皮素具有抗心肌缺血再灌注损伤、抗炎、抗肿瘤、抗高尿酸、抗高血糖等作用[6-10]。连翘酯苷B具有显著的抗炎抑菌、抗氧化的作用[11-12]。因此将其作为连翘的指标性成分进行研究，补充完善药典中连翘药材的质量评价指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity H CLASS超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；CP214电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；H1650-W微量台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；2013QT超声波清洗器（北京碳氢超声波清洗机有限公司）。

1.2 试药

连翘苷，连翘酯苷A，连翘酯苷B，槲皮素对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkp18012210，wkp19010907，wkp18100801，wkp19011509，纯度≥98 %）；数批连翘（青翘）样品采自湖北省十堰市郧县十字沟（批号：20180801， 20180802，20180803），经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为正品；乙腈，甲醇为色谱纯，水为双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），预柱（1.7 μm，VANGUARD）；以0.2 %的甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～15 min，90 %～70 %A；15～25 min ，70 %～30 % A；柱温：35 ℃；流速：0.3 ml/min；在330 nm波长下测定连翘酯苷B和连翘酯苷A的含量，在277 nm波长下测定连翘苷含量，在254 nm波长下测定槲皮素含量。

2.2 供试品溶液的制备

取样品细粉（过3号筛，50目）约1 g，精密称定，于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理（250 W，40 kHz）25 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml置于干锅中蒸至近干，加入0.5 g中性氧化铝拌匀烘干，加在中性氧化铝柱（100～120目，1 g，内径为1～1.5 cm）上，用70 %乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50 %甲醇溶解，转移至5 ml量瓶，并稀释至刻度，摇匀，离心，取上清即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、槲皮素对照品，加70 %的甲醇制成每1 ml分别含0.42，0.92，0.51，0.49 mg混合对照品溶液，摇匀，低温避光保存备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取连翘样品，按照2.2项方法制成供试品溶液，按2.1项色谱条件进样分析，得到样品的UPLC色谱图。参照4个对照品的色谱行为及其DAD紫外检测光谱图，结果见图1。在样品色谱图上对其峰进行指认，标定了4个成分，它们分别是图1中连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷和槲皮素。

图1 UPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察 为分析各药材标定成分的含量分布，按如下方法研究了各标定成分的线性回归分析参数：为分析各药材标定成分的含量分布，按如下方法研究了各标定成分的线性回归分析参数：精密吸取连翘酯苷B储备液（0.42 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；连翘酯苷A储备液（0.92 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；连翘苷储备液（0.51 mg/ml）2，3，4，5，6 μl；槲皮素储备液（0.49 mg/ml）0.2，1.4，2.6，3.8，5 μl，按2.1项下色谱条件进样测定，以进样量(μg)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，各成分回归方程分析参数见表1。结果表明连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷和槲皮素分别在进样量为0.42～2.10，0.92～4.60，1.02～3.06，0.098～2.45 μg范围内与峰面积线性关系良好。

表1 4种成分线性关系考察试验数据

2.4.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，分别记录其保留时间和峰面积，结果表明峰面积的RSD分别为0.28 %，0.73 %，1.35 %和0.57 %，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号20180801），分别于室温下放置0，2，4，6，8，12，24 h，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录其峰面积并计算RSD，结果表明其RSD分别为0.61 %，0.93 %，1.57 %和1.74 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一批样品（批号20180801），按2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件分别进样测定，并计算4种成分含量，其RSD分别为1.81 %，2.04 %，2.61 %和2.39 %，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的连翘粉末样品（批号20180801）6份，各约1 g，精密称定，分别精密加入15ml连翘酯苷B（0.42 mg/ml）、连翘酯苷A（0.92 mg/ml）、连翘苷（0.51 mg/ml）和7.65 ml槲皮素（0.49 mg/ml），按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表1。

表1 连翘中4种成分的加样回收率试验结果

2.5 样品含量测定

精密称取3批连翘样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定4种成分的含量，结果见表3。

表3 4种成分含量测定结果/mg·g-1（n=3）

3 讨论

3.1 提取方法的选择

比较了超声提取、加热回流提取和过中性氧化铝柱子提取3种提取方式，发现用第3种提取方式得到的色谱图峰数较多，能同时检测到4种成分，峰形较好，分离状况令人满意，故选择过中性氧化铝柱子的提取方式。

3.2 波长的选择

用PDA检测器对样品在210～400 nm进行全波长扫描，发现连翘酯苷B和连翘酯苷A最大波长为330 nm，连翘苷和槲皮素分别在277 nm和254 nm波长下有最大吸收，分别在最大吸收波长下测定4种成分的含量。

3.3 流动相的选择

分别考察了乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸为流动相时色谱峰的分离效果。结果，以乙腈-0.2 %甲酸溶液为流动相时分离效果最佳，色谱峰的分离度及峰形均良好，故最终选择乙腈-0.2 %甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

3.4 UPLC与HPLC色谱的对比

对UPLC和HPLC的供试品色谱图进行比较发现，UPLC具有更高的分离度、灵敏度和更快的分离速度，单位时间内能提供更多的信息量，同时更节省流动相。

本文采用UPLC法同时测定连翘药材中4种成分含量，避免了单个成分测定带来的繁琐步骤，减少了流动相的配制和供试品的制备步骤，有效的提高了分析速度，缩短分析周期。该方法简便、快捷、准确且灵敏度高，可为连翘质量评价的科学性和全面性提供一定的参考。