HPLC同时测定花果茶中3种成分的含量

陈 娟，穆庆丽，孟 雪，崔小敏，陈志永，蒙麦侠，郭 冬

（陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

花果茶由金银花、青果、胖大海、麦冬、绿茶、薄荷六味中药组成，为陕西省中医药研究院自制保健产品，具有清热利咽，疏散风热功效。现代研究表明，金银花具有解热、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等药理作用，其中绿原酸是金银花中的主要功效成分[1-3]。绿茶中含有大量的儿茶素、表儿茶素，都属于多酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善糖尿病和神经退行性病变、调节免疫功能等生物活性[4-7]。本实验以自制的花果茶为研究对象，建立了同时测定绿原酸、儿茶素和表儿茶素含量的方法，为该产品的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent，美国），电子分析天平（北京赛多利斯，型号BP125D，d=0.01 mg；BP61，d=0.1 mg）；KH-300D型数控超声波清洗仪（昆山禾创）。

1.2 对照品与试剂

对照品绿原酸（批号：110753-201817），儿茶素（批号：110877-201604），表儿茶素（批号：110878-201703）均购于中国食品药品检定研究院；花果茶（规格：2.5 g/袋；批号分别为20180401，20180402，20180403）由本单位自制；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇（A）-乙腈（B）-0.1 %磷酸水溶液（C）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为1.0 ml/min，检测波长为280 nm，柱温：30℃，绿原酸、儿茶素、表儿茶素分离度均不得低于1.5，理论塔板数均不低于4000。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 分别精密称取绿原酸、儿茶素和表儿茶素对照品适量，加入50 %甲醇溶液制备质量浓度分别为0.047，0.25和0.1213 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品样品约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 %甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按处方工艺制备缺金银花、青果和绿茶的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.4 测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3 专属性试验

分别吸取混合对照品、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，进样分析。结果表明，阴性样品在对照品色谱图主峰位置，无对应色谱峰出现，表明处方中其余组分对结果无影响。色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）；供试品（B）；阴性对照（C）的高效液相色谱图

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下绿原酸、儿茶素和表儿茶素混合对照品溶液2，4，8，12，16，20 μl，在2.1项色谱条件下进行分析，记录色谱图，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表2。结果表明绿原酸、儿茶素、表儿茶素分别在0.0940～0.9400 mg，0.5000～5.0000 mg，0.2426～2.4260 mg范围内线性关系良好。

表2 3种指标性成分的回归方程和线性范围

2.5 检测限和定量限考察

取2.2.1项下对照品溶液适量，逐步稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。分别以信噪比（S/N）为3和10时的对照品浓度为检测限（LOD）和定量限（LOQ）。结果，绿原酸、儿茶素、表儿茶素的LOQ分别为0.0078，0.0165，0.0066 μg，LOD分别为0.0024，0.0050，0.0020 μg。

2.6 精密度试验和中间精密度试验

精密吸取2.2.1项下对照品溶液10 μl，在2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，绿原酸、儿茶素和表儿茶素峰面积的RSD分别为0.10 %，0.18 %，0.22 %，结果表明方法精密度良好。

更换液相色谱仪为岛津2010A-HT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）和色谱柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），方法同精密度项下。结果，绿原酸、儿茶素和表儿茶素峰面积的RSD分别为0.71 %，0.59 %，0.76 %，结果表明方法中间精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批花果茶（批号20180401） 6份，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件下进样分析，记录峰面积。结果绿原酸平均含量为19.85 mg/g，RSD为0.18 %；儿茶素平均含量为29.09 mg/g，RSD为0.16 %；表儿茶素平均含量为14.1175 mg/g，RSD为0.41 %；结果表明，含量测定方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下分别放置0，2，4，6，8，10，12 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、儿茶素和表儿茶素峰面积的RSD分别为0.19 %，0.65 %，0.93 %，结果表明供试品溶液在室温条件下12 h内稳定。

2.9 加样回收试验

精密称取已知各成分含量的样品0.05 g（批号20180401），共称取6 份，置具塞三角瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液1 ml（浓度：1.0070 mg/ml），儿茶素对照品溶液1 ml（浓度：1.4860 mg/ml），表儿茶素对照品溶液1 ml（浓度：0.7295 mg/ml）。按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件下进样测定，计算加样回收率。结果测得绿原酸平均回收率为99.93 %，RSD为1.11 %；儿茶素平均回收率为100.19 %，RSD为1.29 %；表儿茶素平均回收率为100.26 %，RSD为1.74 %；表明该方法准确性良好。结果见表3。

表3 加样回收试验结果 （n=6）

2.10 耐用性试验

取2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件，分别调整波长、流速、柱温，同法测定，考察绿原酸、儿茶素和表儿茶素含量变化。测定结果为绿原酸平均含量为19.7442 mg/g，RSD为0.83 %；儿茶素平均含量为29.5973 mg/g，RSD为0.66 %；表儿茶素平均含量为14.6942 mg/g，RSD为0.94 %；结果表明该方法耐用性好。

2.11 样品含量测定

分别取3批不同样品各约0.1 g，精密称定，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算样品中绿原酸、儿茶素和表儿茶素含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

对3种指标性成分在200～400 nm的紫外吸收全扫描，儿茶素和表儿茶素的最大吸收波长均为280 nm，绿原酸在220，280，327 nm处均有较好的吸收，综合考虑各成分在样品中的最大吸收波长，故以280 nm作为本实验的检测波长。

3.2 流动相的选择

本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液等流动相系统，结果甲醇-0.1 %磷酸水和乙腈-0.1 %磷酸水的分离效果各有优势，但均不能将绿原酸、儿茶素和表儿茶素同时完全分离，最终采用甲醇-乙腈-0.1 %磷酸水三相流动相体系可将三者同时实现基线分离，达到定量测定的要求，且阴性样品无干扰。

3.3 儿茶素和表儿茶素的HPLC含量测定

本实验发现金银花中含有大量的儿茶素和少量的表儿茶素。青果和绿茶中也含有儿茶素和表儿茶素，本实验结果与文献报道一致[8-9]。故本实验中的阴性对照品制备是去掉金银花、青果和绿茶。

综上所述，本研究建立了同时测定花果茶中3种指标性成分的方法，该方法操作简单，易于实施，准确、稳定、重复性好，能够为花果茶的质量控制提供参考。