镇江香醋耐高温优势醋酸菌的筛选及其发酵特性的比较研究

华青松，宗朕，余越，张雨艳，周涛，王周明，柳志杰

(湖北工业大学，工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068)

食醋作为一种调味品，具有丰富的营养和独特的风味，在人们的饮食中占有重要地位。原料经液化、糖化、酒精发酵、醋酸发酵等一系列的发酵过程，最终产生香气宜人、营养丰富的食醋[1]，醋酸发酵是食醋酿造中关键的环节[2，3]。醋酸菌(acetic acid bacteria, AAB)是一类严格好氧的革兰氏阴性细菌，因其氧化乙醇生成醋酸能力强、高耐醋酸等特性而成为醋酸发酵的主要工业菌种[4]。醋酸菌AS1.41是工业上广泛应用的醋酸菌，其最适发酵温度为28～33 ℃[5]。当处于炎热的夏季时，固态酿造中醋醅温度升高，超出了常规醋酸菌适宜的生长温度，严重影响发酵质量，增大发酵成本[6]。因而筛选能够耐高温且高产酸的菌株对于高温条件下固态食醋的酿造具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品来源：江苏镇丹玉香醋酸醅。

试剂：葡萄糖、酵母提取物、CaCO3、NaOH、无水乙醇、琼脂、琼脂糖、MgSO4、酚酞、Taq DNA聚合酶、16S rDNA通用引物、普通凝胶DNA回收试剂盒、1 kb DNA Marker。

仪器：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、立体培养摇床、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、气相色谱-质谱连用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)。

1.2 培养基

固体培养基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%、CaCO32%、琼脂2%，115 ℃ 0.1 MPa灭菌20 min，待温度降至50 ℃，加入4%无水乙醇。

液体培养基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%，115 ℃ 0.1 MPa灭菌20 min，待温度降低至室温，加入4%无水乙醇。

1.3 试验方法

1.3.1 菌落筛选及纯化

取5 g醋醅，30 ℃，200 r/min液体培养活化20 h，取活化后的菌液用生理盐水梯度稀释至10-5后，均匀涂布于固体培养基上，37 ℃恒温培养4～5 d。用接种环挑取长势良好且产生较大透明水解圈的单菌落用于平板划线法分离纯化。

1.3.2 产酸定性试验[7]

挑取纯化后的菌落，接种于液体培养基，30 ℃培养72 h，取5 mL菌液，离心取上清液，以2.5 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，加入5% FeCl3溶液5～6滴，形成红褐色沉淀即为产醋酸细菌。

1.3.3 菌株的16S rDNA鉴定

PCR扩增体系：15 μL ddH2O、20 μL 2×Taq酶、2 μL引物27F、2 μL引物1492R、1 μL菌液作为模板。

扩增条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性8 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃终延伸5 min，循环30次。

PCR产物进行凝胶电泳，并加入DNA Marker作对比，将大小为1500 bp左右的片段切下用作凝胶DNA回收，最终产物送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果用DNAStar拼接后，在NCBI中进行同源序列对比，选定相似度高的序列用MEGA 7.0构建系统发育树[8]。

1.3.4 菌种生物量(OD600)的测定

将AABA、AABC、AS1.41 这3株产酸菌按初始OD的0.01接种量，在30，37，40 ℃下，200 r/min摇瓶培养，测定不同培养时间的OD600，绘制相应生长曲线。

1.3.5 产酸量的测定[9]

每隔24 h取上述培养菌液5 mL，滴加2～3滴1%的酚酞试剂，用0.5%的NaOH标准溶液滴定，再根据碱液的消耗量来确定产酸量，公式为：

式中：V为滴定NaOH消耗的体积；V0为空白对照组消耗NaOH的体积；CNaOH为NaOH的浓度；60为NaOH的相对分子质量[10]。

1.4 耐高温醋酸菌的脂肪酸组成分析

取菌液离心后的菌体0.5 g，加入5 mL醋酸，涡旋混匀后加入20 mL氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液，缓慢水浴振荡30 min,3000 r/m离心10 min，取最下层液体，涡旋蒸发至干燥，加入0.1 mg十五酸、3 mL硫酸-甲醇溶液复溶，90 ℃放置2 h，加入1 mL 0.9%氯化钠溶液和500 μL正己烷，涡旋混匀，10000 r/min离心10 min，取有机层，即为脂肪提取物，再将提取的醋酸菌粗脂肪通过GC-MS分析脂肪酸组成。

1.5 数据处理

所有试验重复3次，数据用SPSS 20和Origin 2017统计软件处理。

2 结果与讨论

2.1 耐高温醋酸菌的初步筛选

将活化后的菌液均匀涂布在含CaCO3的固体培养基上，37 ℃恒温培养3～5 d。根据醋酸菌菌落特征，挑选菌落形态为圆形，中部凸起，表面呈光滑油脂状，边缘整齐且透明圈较大的菌落，进行划线纯化培养3次，随后进行产酸定性试验，进一步在液体培养基中37 ℃培养复检，初步筛选出2株耐37 ℃的产酸菌株，分别命名为菌株AABA和菌株AABC。

2.2 产酸菌株的鉴定

16S rRNA是细菌核糖体RNA的亚基之一，其编码基因为16S rDNA，16S rDNA编码序列由保守区和可变区交替组成，其中保守区序列体现了细菌种间亲缘关系，而可变区则体现了细菌的种间差异，通过对16S rDNA的扩增和测序可以快速、精确地鉴定未知菌种，比传统细菌鉴定方法更为高效和精确[11]。

本试验通过菌液PCR，对相应菌株的16S rDNA进行扩增，电泳结果见图1。

图1 AABA、AABC两株菌16S rDNA PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of two strains of AABA and AABC

初步确定约1500 bp的扩增片段为对应菌株16S rDNA，随后进行凝胶DNA回收和测序。测序结果用DNAStar进行拼接，确定菌株AABA的16S rDNA片段长度为1359 bp，菌株AABC的片段长度为1357 bp，再将序列在NCBI进行同源序列Blast比对。

菌株AABA与NCBI同源序列Blast比对结果见表1。

表1 菌株AABA与NCBI数据库比对结果Table 1 Comparison results of strain AABA and NCBI database

续 表

由表1可知，选取与菌株AABA相似度最高的6株菌均属于巴氏醋酸杆菌属，菌株AABA与NCBI数据库中已知巴氏醋酸杆菌皆有较高的相似度。测序结果采用相邻法构建系统发育树，见图2。

图2 菌株AABA的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain AABA

由图2可知，菌株A和KT283054.1Acetobacterpasteurianusstrain FY-24等巴氏醋杆菌菌株亲缘关系较近，相似度达到100%，因此确定菌株AABA属于巴氏醋酸杆菌属。菌株AABC与NCBI同源序列Blast比对结果见表2。

表2 菌株AABC与NCBI数据库比对结果Table 2 Comparison results of strain AABC and NCBI database

由表2可知，菌株AABC与NCBI数据库比对中，与Acetobacterpasteurianusstrain DHMV3706等菌的相似度接近100%，再构建菌株AABC的系统发育树，见图3。

图3 菌株AABC的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain AABC

由图3可知，AABC与巴氏醋酸杆菌属的亲缘性较好，相似度可达100%，从而判定菌株AABC属于巴氏醋酸杆菌属。

2.3 温度对产酸菌生长的影响

大部分醋酸菌的最适生长温度在30～35 ℃，温度过低菌株生长缓慢，温度过高则抑制其生长，老化加快，降低产酸速率，甚至导致菌体死亡[12]。为了探究高温对所筛选菌株的影响，分别在30，37，40 ℃温度下对其进行液体培养，以工业菌株AS1.41作为参照，测定筛选菌株的生长曲线,结果见图4。

图4 不同温度下菌株的生长曲线Fig.4 Growth curves of strains at different temperatures

由图4可知，在30 ℃培养条件下，菌株AABC生长达到稳定期时间晚于AS1.41,但OD600值相差不大。而AABA相比于AS1.41和AABC生长较差，最终生物量仅为两个菌株的一半。在37 ℃下培养时，AS1.41和AABC生长均受到一定抑制，而AABA则表现出较好的生长状况，两株筛选菌与AS1.41在生物量方面没有显著差别。说明菌株AABA最适生长于温度高于30 ℃的条件下。40 ℃下菌株AABA、AS1.41基本不生长，而菌株AABC生长状况虽然同较低温度相比，生物量呈下降趋势，但最大OD600与30 ℃时接近。菌株AABA和AS1.41在培养第3天后就开始衰亡，而菌株AABC从第6天开始进入衰亡期，说明在40 ℃时菌株AABC虽然生长较慢，但仍可以达到较高的生物量。

2.4 温度对产酸菌株产酸量的影响

醋酸菌产酸能力是评价醋酸菌特性的重要指标之一。醋酸菌产酸速率及产酸量会受到温度的影响，温度太高会抑制菌株的生长代谢，从而降低产酸量，因此评价耐高温醋酸菌的产酸能力，对其实际应用具有重要的意义。本试验分别测定了30，37，40 ℃ 3个温度下菌株AABA、AABC、AS1.41的产酸量，3株菌株在不同温度下的最高产酸量见图5。

图5 30，37，40 ℃下AABA、AABC和AS1.41的产酸量Fig.5 Acid production of AABA,AABC and AS1.41 at 30，37，40 ℃

由图5可知，当培养温度为30 ℃时，菌株AABC与AS1.41产酸量都在30 g/L左右，菌株AABA产酸量稍低；当培养温度为37 ℃时，菌株AABA和AABC的产酸量有显著增长，其中菌株AABA的产酸量可达到45.5 g/L，而AS1.41同30 ℃相比，产酸量显著下降为16.0 g/L。培养温度为40 ℃时，菌株AABC的产酸量为28.0 g/L，而菌株AABA和AS1.41基本不产酸。因此可以得出，AABA在37 ℃下具有比工业菌株AS1.41更高的产酸量，AABC在40 ℃高温下生长状况较好，且有较高的产酸量，说明AABC和AABA在高温下具有比工业菌株AS1.41更好的表现，为耐高温优势产酸菌株。

2.5 脂肪酸组成分析

微生物生长过程中，细胞膜脂肪酸组成呈动态变化，细胞中不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸组成随细胞生长环境条件，如温度、pH或各种生长因子存在状况及生长期等变化发生改变[13-15]。微生物会通过调节细胞膜脂肪酸组成成分改变细胞膜的流动性来应对不利的外在环境。本试验研究了30，37，40 ℃下菌株AABC以及30，37 ℃下AS1.41的脂肪酸组成，从脂肪酸组成的变化来初步探究醋酸菌耐高温的机理。利用GC-MS测定脂肪酸组成，得到脂肪酸相对含量结果，见图6。

图6 温度对醋酸菌细胞膜脂肪酸的组成成分影响Fig.6 Effect of temperature on the composition of fatty acids in acetic acid bacteria cell membrane

由图6可知，温度从30 ℃上升到40 ℃时，菌株AABC中C14∶0含量呈明显的下降趋势，从36.28%下降到9.3%，C16∶0呈显著上升趋势，从18.77%上升到47.8%。相比于AS1.41，在37 ℃时，菌株AABC的C14∶0含量较高，C16∶0含量较低。随温度上升，两株菌C18∶1和C18∶2含量上升，因而推测，为适应不利环境，细胞膜中不饱和脂肪酸相对比例提高，增强了细胞流动性，对细胞内外物质交换以及代谢进程产生影响，从而提高细胞对恶劣条件的抵抗能力。

3 结论

镇江香醋发酵过程中，醋酸菌具有重要的作用，会对食醋的品质和风味产生重要影响。本试验从镇江香醋醋醅中筛选、纯化、鉴定得到两株具有一定高温耐受性和产酸能力的巴氏醋酸杆菌属菌株——AABA和AABC。通过对其发酵性能进行研究发现，37 ℃下菌株AABA生长状况好，具有较强的产酸能力，产酸量为45.5 g/L。而菌株AABC在40 ℃高温下，生长状况良好，产酸量达到28 g/L。通过对细胞膜脂肪酸相对含量进行分析发现，随着温度的升高，细胞膜不饱和脂肪酸相对含量提高，可能是由于不饱和脂肪酸相对含量的提高增强了细胞膜的流动性，从而提高了醋酸菌对高温条件的适应能力。本研究对耐高温优势醋酸菌的筛选及对耐高温机理的初步探讨为高温条件下高品质固态发酵食醋的酿造提供了参考。