不同检测方法对石蜡组织块的结核分枝杆菌检测的对比分析

蒋丽超，钟定荣，杨 锐，吴俊秀，王 也，姜睿盈，于婉超

（中日友好医院 病理科，北京 100029）

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核菌可能侵入人体全身各种器官，主要侵犯肺脏，称为肺结核病，对人体危害很大。长期以来，结核病由于其强烈传染性，一直困扰大众。组织标本应用抗酸染色法检测结核分枝杆菌，其敏感性低，使得检出的阳性率低，难以满足患者和临床的精准诊疗需求[1]。近年来，随着分子生物学技术的高速发展，因其具有较高的敏感性和特异性而广泛应用于各种病原体的核酸检测[2]。

本文对2017～2019年中日友好医院病理科168例病理形态疑为肺结核病患者的石蜡包埋组织抗酸染色、荧光PCR 法以及PCR-反向点杂交法检测结核分枝杆菌进行对比分析，旨在评价不同检测方法的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床材料

2017年1月～2019年1月我科病理形态疑为肺结核病患者168例，其中男80例、女88例；年龄15～86 岁，平均51.45 岁。中位数年龄53.5 岁。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色法

组织切片脱蜡至水，应用BenchMark 全自动特殊染色机进行染色。结果判定：镜下见到鲜红色杆状、略弯曲、串珠状的抗酸杆菌为阳性。

1.2.2 荧光PCR 检测

对组织切片进行脱蜡处理后，提取DNA（厦门艾德生物医药科技股份有限公司），然后按照程序进行DNA 扩增和分析（ABI7500，美国）。结果分析：反应结束后保存检测数据文件，以Ct 值的范围来判定结核分枝杆菌的检测结果：Ct＜16 为强阳性，16～22 为阳性，22～28 为弱阳性，＞28为阴性。

1.2.3 PCR-反向点杂交法

对组织切片进行脱蜡处理后，提取DNA（厦门艾德生物医药科技股份有限公司），进行DNA 扩增及杂交（ABI7500），取出膜条浸泡显色液中（亚能生物技术有限公司），避光显色后观察结果。结果判定：根据膜条上蓝色斑点显现的位置，读取相应位置标注的基因型信息。

2 结果

以形态学可见上皮样肉芽肿性炎，并伴干酪样坏死为肺结核病诊断标准，168例病理形态学疑似肺结核病患者中有51例病理诊断确诊为肺结核病。

表1～表4示，168例疑似患者抗酸染色法、 荧光PCR法以及PCR-反向点杂交法的阳性率分别是20.8%、29.1%、13.7%；抗酸染色法、荧光PCR 法以及PCR-反向点杂交法的灵敏度分别是51.0%、66.7%、35.2%；特异度分别是92.3%、87.1%、95.7%； 准确度分别是80.0%、81.0%、77.4%。

其中抗酸染色法特异度（92.3%）最高，荧光PCR 法的阳性率（29.1%）、灵敏度（66.7%）及准确度（81.0%）最高，综合评价荧光PCR 法优于其他2 种方法。

3 讨论

病理诊断中常用抗酸染色法检测结核分枝杆菌，抗酸染色法被视为诊断结核病的金标准，是最经典、常用检测结核分枝杆菌的方法，具有操作方便，价格便宜的优点，且是最直观可见结核杆菌的方法，但其阳性率（20.8%）略低。由于组织学染色是一种多步骤诊断过程，染色前对组织的处理和加工过程中存在人为因素影响，如染色时间、切片厚度、镜检经验等因素，易出现假阴性或者假阳性。应用智能特染机器进行抗酸染色，一定程度上避免了人为操作失误，使其准确度得到了一定提升。病理诊断判定标准是找到抗酸染色阳性杆菌，但其阳性结果显示既可能是结核杆菌，也可能是非结核分枝杆菌或者麻风杆菌等，所以需要我们应用其它检测手段，即PCR-反向点杂交法辅助诊断。

表1 3 种检测方法对比结果 （%）

表2 抗酸染色和病理形态学诊断肺结核的对比结果 （n）

表3 荧光PCR 法和病理形态学诊断肺结核的对比结果 （n）

表4 PCR-反向点杂交法和病理形态学诊断肺结核的对比结果 （n）

荧光PCR 法为专项检测结核分枝杆菌的实验方法，其阳性率（29.1%）是3 种方法中最高的，虽然在结果评定中存在假阳性的可能，对于存在界限不清者可重复操作多次，确保结果准确。且其灵敏度（66.7%）对比其他2 种检测方法高，优势显著，但其单一性具有一定局限，使得此方法仅适用于结核分枝杆菌检测。PCR-反向点杂交法的灵敏度（35.2%）和准确性（77.4%）均不高，且其阳性率（13.7%）较低，存在很大的漏诊率。但是PCR-反向点杂交法特异性（95.7%）最高，可以检测不同类型分枝杆菌，既可以鉴定抗酸染色阳性是否为结核分枝杆菌抑或是其他类型分枝杆菌，也可辅助抗酸染色的结果证明，使得判定结果更加准确[3]。无论是哪一类检测方法，用石蜡组织块都存在实验中含有石蜡杂质，抑制试剂反应均易出现假阴性，在实验过程中严格按照实验要求操作，减少误差，避免交叉污染[4]。

虽然目前没有一种方法可以完全取代其他方法作为病理诊断的唯一标准，但综合评价对比分析，荧光PCR 法优于其他2 种方法，可作为肺结核病诊断的优选方法[5]。在实际工作中，可以选择多种方法联合检测，并结合患者的病史、临床症状、影像及病理等资料，对肺结核病做出正确的诊断，可以有效减少误诊、漏诊的发生[2]。