p97蛋白在宫颈病变中的表达与临床意义

杨文艳，贺桂芳，马 莉，卞美璐，原亚莉，张 媛，李 纯

（1.北京大学医学部，北京 100091；2.中日友好医院 妇产科，北京 100029；3.清华大学第一附属医院 妇产科，北京 100061；4.北京市西城区妇幼保健院，北京 100052）

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，据报道，每年全球约57 万例新发宫颈癌患者，死亡例数达32 万左右，其中，发展中国家占85%以上[1]。人乳头瘤病毒（HPV）联合细胞学检查是目前早期发现宫颈癌的主要手段，但是，我国宫颈癌5年生存率仅为36.9%[2]，远低于欧美国家，主要原因是我国患者初次就诊已是中晚期。因此，寻找新的检测宫颈癌病情发展的生物标记物成为研究热点。有研究报道[3～5]，含缬氨酸蛋白p97 与结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展及预后相关。p97 蛋白通过控制蛋白质质量及调节NFγB 活性、细胞增殖、抗凋亡的过程，影响恶性肿瘤的远处转移[6～8]。但p97 蛋白在宫颈癌中的研究少有报道，本研究通过检测宫颈组织中p97 蛋白表达变化，探讨其与宫颈癌的相关性及p97 蛋白表达对预测病情进展及预后的临床价值，旨在为宫颈癌的早期诊断、病情监测及预后评估提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 资料来源

选取2011年8月～2017年10月中日友好医院妇科的手术标本259例，其中宫颈癌组101例，年龄 （50.02±9.40）岁；CIN1 组48例，年龄为（41.27±9.26）岁； CIN2 组50例，年龄为（38.60±8.02）岁，CIN3 组40例，年龄为（42.53±10.66）岁；以同期因良性子宫疾病行子宫全切除术患者（20例）作为对照组，年龄为（42.76±7.80）岁。5 组间年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

CIN1 组、CIN2 组、CIN3 组及宫颈癌组患者的纳入标准：临床资料完整，且术前未接受过放、化疗。对照组患者的纳入标准：（1）因良性子宫疾病而行子宫全切除术者，包括子宫肌瘤、子宫腺肌瘤等；（2）子宫颈液基薄层细胞学检查（TCT）未见非典型鳞状细胞或癌细胞。

排除标准：（1）术前3 个月内曾行子宫颈治疗，如阴道用药、激光治疗等；（2）患者为妊娠状态；（3）同时合并其他妇科恶性肿瘤，如子宫内膜癌、卵巢上皮性癌等；（4）同时合并其它器官肿瘤，如肠、乳腺肿瘤等。

所取标本均经本院2 名病理科医师核实。研究已通过我院伦理委员会批准，所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 免疫组化染色及评分

操作方法按试剂盒说明书，兔抗人p97 单克隆抗体（货号：ab109204 1：200 稀释），SP 及DAB试剂盒（货号：ab64261）均购买自Abcam 公司。以PBS 缓冲液替代一抗作阴性对照。结果判定参照文献，以细胞质或细胞膜出现棕色染色者为阳性细胞。高倍镜（×400）下随机选取5 个不同视野，5个视野平均分作为该标本的最终得分。阳性细胞所占百分比评分：＜5%为0 分，5%～24%为1 分，25%～49%为2 分，50%～79%为3 分，≥80%为4分；染色强度评分：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分，以两者乘积作为总分。最终得分0～3 分为弱阳性（+），4～6 分为阳性（⧺），7～9 分为强阳性（⧻），10～12 分为极强阳性（）。

1.3 HPV 检测方法

采用荧光PCR 技术对HPV DNA 分型检测，主要试剂及仪器包括SLAN-96 PCR 仪 （上海宏石），HR-HPV 基因分型检测试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司），5810R 台式高速冷冻离心机（德国Eppendoff 公司）。按试剂盒操作要求进行扩增剂的配制和病毒核酸提取，循环参数为94℃10min； 93℃10s-62℃31s，循环40 次，单点荧光检测在62℃，荧光通道选择FAM 和VIC 通道，检测13 种高危型HPV。

1.4 随访方法

101例术后病理确诊的宫颈癌患者，随访从入院d1 开始计算，至2019年2月1日截止，总生存时间从术后d1 开始至死亡或末次随访时间。宫颈癌术后2年内每3 个月复查1 次，3～5年内每6 个月1次，第6年后每年复查1 次。

1.5 统计学方法

采用SPSS23.0 软件，计量资料经正态性检验符合正态分布，以±s 表示。计数资料比较采用χ2检验及确切概率Fisher 法。诊断试验采用受试者工作特征（ROC）曲线，患者累积生存率用Kaplan-Meier 单因素分析，生存率比较用log-rank检验。

2 结果

2.1 p97 蛋白在不同宫颈组织中的表达

对259例患者的宫颈组织进行免疫组织化学染色，结果显示，p97 蛋白主要表达于宫颈上皮细胞的细胞质，在对照组低表达，随宫颈病变病情进展，p97 蛋白表达水平逐渐升高，见图1（封二）。分析不同宫颈病变组织p97 蛋白表达水平差异性，表1示，CIN 的3 个组、 宫颈癌组与对照组比较，均具有显著性差异（均P＜0.05）。CIN3 组与宫颈癌组比较，具有显著性差异（P＜0.05）。

将宫颈癌组织中p97 蛋白染色评分进行汇总，以正常宫颈组织中的p97 蛋白染色评分为参照值，采用受试者工作特征（ROC）曲线，分析p97蛋白不同评分诊断宫颈癌的效能。结合SPSS 统计结果，A 点是Youden 指数最大的切点，其临床意义是：p97 蛋白免疫组化染色评分为4.0 分时，p97 蛋白诊断宫颈癌的灵敏度为67.5%，特异度为65%。ROC 曲线下面积为0.720，标准误为0.055，95%可信区间为（0.613，0.828），见图2。

2.2 p97 蛋白表达与宫颈癌临床病理参数的关系

表1 p97 蛋白在不同宫颈组织中的表达 n（%）

根据101例宫颈癌患者的临床资料，结合p97 蛋白表达水平进行分析，结果显示宫颈癌组患者p97 蛋白表达水平与病理分化程度、 肿瘤直径、 淋巴转移、HPV 感染及SCC 值明显相关 （P＜0.05，P＜0.01），而与年龄、组织类型、FIGO 分期、脉管浸润均无关（P＞0.05），见表2。

图2 p97 蛋白ROC 曲线

表2 p97 蛋白与宫颈癌临床病理参数

2.3 p97 蛋白表达与宫颈癌预后的关系

根据p97 蛋白表达水平，将患者分为2 组进行分析： 染色评分＜4 分为低表达组，≥4 分为高表达组，根据随访宫颈癌术后患者的情况，101例宫颈癌患者中，p97 蛋白高表达组71例，其中8例发生终点事件； 低表达组30例，3例发生终点事件，Kaplan-Meier 生存分析显示，宫颈癌中低表达组中位生存时间估算51.55 个月，高表达组中位生存时间估算34.27 个月。2 组肿瘤患者整体上的生存曲线比较，Log-Rank 法检验统计量χ2=7.178，P=0.007，p97 蛋白高表达组的总生存率显著低于p97 蛋白低表达组，见图3（封二）。

3 讨论

3.1 p97 蛋白与肿瘤细胞生长的关系

p97 蛋白广泛存在于人体细胞内，与蛋白辅助因子如Npl4/Ufd1、p47、UBXD1、 泛素连接酶RNF138 等结合，参与细胞内多种信号通路，影响细胞蛋白质质量控制、基因表达、转录活性、膜融合、细胞周期调控等生理过程[9，10]。p97 蛋白是细胞内蛋白质质量控制的关键参与者。正常情况下，人体内的细胞会产生一些错误折叠或受损的蛋白，这些残次蛋白堆积诱导细胞死亡，p97 蛋白介导泛素蛋白酶系统清除残次蛋白，控制细胞内蛋白质质量，维持细胞存活。而肿瘤细胞的生长、存活更加依赖p97 蛋白。肿瘤细胞不可控性增殖分裂，产生大量残次蛋白，p97 蛋白显著激活，清除肿瘤细胞内大量残次蛋白，与肿瘤细胞的生长密切相关。Skrott 等[11]研究双硫仑抗肿瘤机制时发现，该药进入小鼠乳腺癌细胞内，主要通过其分解物CuET 与NPL4 结合，抑制p97 蛋白发挥作用，细胞内残次蛋白堆积，导致癌细胞死亡。p97 蛋白还通过调控NFγB 活性发挥抗凋亡活性[8]。转录因子NFγB 具有抑制细胞凋亡的作用，p97 蛋白与泛素化的I-γB（NFγB 的抑制蛋白）结合，将其运输至蛋白酶体降解，导致I-γB 失活，使NFγB 游离并进入细胞核与DNA 结合，调控基因表达，阻止细胞凋亡。

3.2 p97 蛋白抑制剂

关于p97 蛋白抑制剂的研究，Anderson 等报道药物CB-5083 负性调控p97 蛋白表达，导致细胞内泛素化蛋白的堆积，内质网相关降解（ERAD）途径停滞，细胞内错误蛋白堆积，产生不可逆的蛋白应激反应，致细胞凋亡具有抗肿瘤活性[12]。因此，p97 蛋白有望成为抗肿瘤治疗的靶点。

3.3 p97 蛋白与妇科肿瘤的相关性

妇科肿瘤研究方面，p97 蛋白抑制剂DBeQ可与p97 蛋白结合，致卵巢癌细胞停滞于G1 期，减弱cap 依赖性翻译，导致癌细胞死亡[13]，推测p97 蛋白抑制剂可能抑制NFγB 活性，促进癌细胞凋亡。Mohammed 等[14]采用免疫组化和免疫印迹技术，检测宫颈癌、 相邻正常宫颈组织及CIN中p97 蛋白的表达，发现不同宫颈病变间p97 蛋白差异具有统计学意义（P＜0.05）。目前，国内尚无关于p97 蛋白与宫颈癌的研究报道，我们的结果显示p97 蛋白在宫颈癌中显著高表达，在正常组织及癌前病变中低表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

p97 蛋白与宫颈癌细胞HPV 感染相关，但机制尚不清楚，目前研究认为[15]，HPV 持续感染与病毒转化基因E6、E7 的表达密切相关，位于长控序列的启动子P97 主要调控E6、E7 基因转录，对病毒DNA 的复制至关重要。在体内外，E6-E6AP 复合物通过酪氨酸磷酸酶PTPN3 调节p97 蛋白，影响宿主细胞内的蛋白质代谢。本研究结果显示，p97 蛋白与HPV 感染相关，而且，p97 蛋白表达水平随宫颈病变进展逐渐升高，染色评分4 分为最佳临界值，其灵敏度67.5%，特异度65%。目前，宫颈癌的早期筛查主要依靠细胞学检查和HPV 检测，其中，液基细胞学检查有效地降低了宫颈癌的死亡率[16]，但是细胞学检查对于宫颈高级别病变的诊断效能较低，存在一定的假阴性[17]，HPV 检测能有效分类ASCUS/ASC-H，其灵敏度达86%，降低了患者的假阴性率，但是，HPV 检测特异度较低（约31%），造成不必要的转诊[18]。p97 蛋白可能成为早期诊断宫颈癌的指标，p97 蛋白与HPV 检测的联合诊断有待进一步临床实验验证。

3.4 p97 蛋白表达与肿瘤预后的关系

许多研究表明，p97 蛋白高表达与恶性肿瘤的不良预后相关，Yamamoto 等[3～5]报道p97 蛋白高表达的结直肠癌患者具有较高的术后复发率和较低的生存率，p97 蛋白高表达的肝细胞癌具有较高的门静脉侵犯潜能，与正常乳腺上皮相比，p97蛋白在癌细胞的细胞质中表达显著增加，与乳腺癌患者总生存率下降相关。推测癌细胞产生大量p97 蛋白清除残次蛋白，维持癌细胞存活，而未完全清除残次蛋白诱导内质网应激，癌细胞发生上皮细胞间质转型，致使肿瘤发生远处转移[19]。我们的研究显示，p97 蛋白高表达组总生存率明显低于低表达组，且p97 蛋白与宫颈癌淋巴转移相关，淋巴转移的宫颈癌患者中p97 蛋白高表达率为81.8%（9/11）。提示p97 蛋白可能成为检测宫颈癌进展的有效指标。另外，p97 蛋白与SCC 值相关，具体分子机制有待进一步研究。

综上所述，p97 蛋白与宫颈癌的发生、发展及远处转移密切相关，有望成为宫颈癌早期诊断、预后评估新的分子标记物，同时，p97 蛋白在宫颈癌组织尤其在不良预后宫颈癌中的高表达，其可能成为晚期宫颈癌治疗的新靶点。

图1 不同宫颈组织p97蛋白染色（HE×100）

图3 宫颈癌中p97蛋白的生存曲线