复方黄黛片对Solt-Farber原发性肝癌大鼠血管新生作用的影响

遆振宇，高小鹏，千东维，慕喜喜

原发性肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，约占我国全部癌症患者数的20%，具有手术切除率低、死亡率高及治疗难度大等特点。寻找有效的抗肝癌药物是肿瘤内科亟需开展的重大课题[1-2]。研究结果表明，肿瘤的浸润、侵袭及转移是导致肝癌患者病情恶化的主要原因之一，其中血管的新生作用是造成癌细胞增殖及转移的主要因素[3-4]。由此可见，抑制肿瘤组织血管的生成对于治疗恶性肿瘤具有重要意义[5]。复方黄黛片是临床常用的抗癌药物，尽管其主要成分丹参及雄黄可有效抑制肿瘤组织血管新生，但该药物用于抗肝癌的研究较少，而考察其对于血管新生作用影响的研究亦未见开展[6]。为此，本研究观察了复方黄黛片对Solt-Farber原发性肝癌大鼠的治疗作用及其对肝癌组织血管新生作用的影响，期望为肝癌的新药研发提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只SD大鼠，6周龄雄性清洁级，体重180～220 g，均购自陕西中医学院动物中心，动物许可证号SCXK（陕）2016-0098。饲养条件均为食物饮水不受限，常温，55%湿度及昼夜各半。适应性喂养1周后进行后续研究。

1.2 仪器及试剂 AS2型显微照相系统（美国奥林匹斯公司）；TY-98型全自动血液分析仪（美国博大公司）；GF-5型全自动定量酶标仪（北京梅赛博公司）；QA-6型高速离心机（德国爱芬公司）。羧甲基纤维素钠（美国天地公司，批号20160212）；一抗兔抗低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）及血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）抗体（美国天地公司，批号依次为00813312、00813972及00812412）；二抗HIF-1α、VEGF及VEGFR-2抗体（美国天地公司，批号依次为23091134、23093526及23097761）。天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）及丙氨酸转氨酶（ALT）检测所需试剂盒（武汉安得生物公司，批号分别为2016041302、2016021734及2016011023）。复 方 黄 黛 片(安徽省天康药业有限公司，批注文号：国药准字Z20090788)。

1.3 给药剂量 参考相关动物与人体剂量的转换公式[7]可知，大鼠剂量（mg/kg）= 6.25 × 成人剂量（mg/kg），其中成人体重以60 kg计。复方黄黛片中使用说明书中给药剂量为1.35 g/60 kg，故大鼠常用剂量（mg/kg）= 1.35 g/60 kg × 6.25 =140 mg/kg。设置该剂量为中剂量组（140 mg/kg），2倍常用剂量为高剂量组（280 mg/kg）,1/2常用剂量为低剂量组（70 mg/kg）。

1.4 实验动物分组、造模及给药方法 将上述50只SD大鼠随机分为正常组、模型组、复方黄黛片高剂量组、复方黄黛片中剂量组及复方黄黛片低剂量组，简称为高、中及低剂量组。采用Solt-Farber二步法[8]对除正常组外各组大鼠进行原发性肝癌造模。第1 天，根据50 mg/kg的给药剂量一次性腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）作为肝癌启动剂。注射2周后，均以15 mg/(kg·d)的给药剂量灌胃给予二乙酰氨基芴（2-AAF），连续灌胃7 d。第3周末，对各组大鼠进行2/3肝部分切除术，将大鼠肝左叶及中叶切除。同时种植红色荧光蛋白所标记的骨髓干细胞于大鼠肝右叶的中心点、12点、9点、6点及3点钟位置，每个注射位置均注射0.1 mL骨髓干细胞溶液（溶液浓度约106个细胞/mL）。注射完成后分层缝合。行肝部分切除术4 d后，采用灌胃法对高、中及低剂量组大鼠进行给药复方黄黛片，剂量分别为280、140及70 mg/kg，连续灌胃18周。正常组及模型组大鼠仅给予等量生理盐水。

1.5 取材方法 末次灌胃给药12 h后，用乙醚将所有大鼠麻醉。采用腹主动脉取血法取血4 mL，在0 ℃条件下低温离心5 min（离心半径15 cm，3000 r/min）进行分离血清处理。采用全自动血液分析仪（CC-hj型；美国博大德生物科技有限公司）检测其中AST、ALT及TBIL含量。取血完成后，利用颈椎脱臼法处死各组大鼠，解剖腹腔并剪取肝脏，并将其平均分为4部分，均以10%福尔马林溶液固定。取其中一份，采用苏木素-伊红染色（HE染色）进行病理组织学观察。另取3份肝脏组织，依次进行抗原修复、一抗结合、二抗结合、复染及封片处理，采用免疫荧光法检测其中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2的表达情况，阳性表达呈红色状。利用AS2型显微照相系统对其进行拍照，采用Image-proplus 6.0软件分析各组大鼠肿瘤组织中上述蛋白的相对表达量。

1.6 数据处理方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。本研究的计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用双侧t检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 复方黄黛片对大鼠血清肝功能指标的影响 本研究在造模过程中，模型组、高、中及低剂量组分别存活9只、9只、10只及9只，存活的大鼠均造模成功。与模型组比较，正常组、复方黄黛片高剂量组、复方黄黛片中剂量组及复方黄黛片低剂量组大鼠血清中ALT、AST及TBIL均明显降低（P＜0.05）。与正常组比较，复方黄黛片高剂量组、复方黄黛片中剂量组及复方黄黛片低剂量组大鼠血清中ALT、AST及TBIL均明显增高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清肝功能指标比较

2.2 复方黄黛片对大鼠组织病理学的影响 HE染色结果表明，正常组肝细胞形态正常，无炎性细胞浸润，肝小叶结构正常且门管区清晰可见。模型组肝组织中癌细胞呈不同程度的分化，排列成巢状，核仁突出，且异型较为明显。复方黄黛片高剂量组、复方黄黛片中剂量组及复方黄黛片低剂量组大鼠肝组织均出现癌变，癌细胞呈梁状排列，核仁较为突出，且异型较为明显，但癌变程度均不及模型组。见图1。

2.3 复方黄黛片对大鼠肝组织HIF-1α、VEGF及VEGFR-2表达的影响 荧光免疫组化中，HIF-1α、VEGF及VEGFR-2阳性均呈红色分布于肝脏细胞核中，呈现颗粒状分布。模型组大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2均呈强阳性表达，正常组中则仅偶见表达，而复方黄黛片高剂量组、复方黄黛片中剂量组及复方黄黛片低剂量组大鼠肝组织中则出现不同程度的阳性表达，且表达情况均明显低于模型组（图2～4）。定量分析结果表明，与模型组比较，正常组、高、中及低剂量组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相对表达量均明显降低（P＜0.05）。与正常组比较，高、中及低剂量组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相对表达量均明显增高（P＜0.05）。见表2。

图1 各组大鼠组织病理学观察结果

图2 各组大鼠肝组织中HIF-1α的表达情况

图3 各组大鼠肝组织中VEGF的表达情况

图4 各组大鼠肝组织中VEGFR-2的表达情况

表2 各组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF及VEGFR-2的相对表达量比较

3 讨论

原发性肝癌是我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，尽管随着外科手术、放疗及化疗方法的不断发展，目前肝癌的临床治疗效果已得到了较大的提升。但总的来说，该疾病的生存率仍较差，故还应对治疗方法进行更系统全面的优化[9-10]。原发性肝癌是一类典型的富血管恶性肿瘤，其中新生血管的生成作用在肝癌细胞的生长与浸润中起到重要作用。而肝癌的血管生成作用是一个极为复杂的生理及病理过程，涉及到多类型血管生成调控因子之间的相互协调[11-12]。其中VEGF是已发现的最重要的血管生成调控因子之一，可通过与肿瘤组织中血管内皮细胞表面受体特异性结合而产生促进新生血管形成及促进内皮细胞增殖等作用[13]。VEGFR-2则是机体中最常见的VEGF受体之一，与VEGF蛋白相互结合后可发生一系列自身磷酸化，并诱导多种类型调控血管生成作用的信号传导，在肝癌病灶的血管生成中扮演着重要角色[14]。此外，随着人体肝癌病灶体积的不断增长，肿瘤细胞对内环境中氧的需求量亦随之增高，病灶中相对的缺氧环境可促进肝癌细胞分泌HIF-1α，而该蛋白是一种可促进VEGF合成与分泌的蛋白，从而产生促血管新生活性[15-16]。

复方黄黛片主要由青黛、太子参、丹参及雄黄等药材所组成，具有益气生血、扶正祛邪及清热解毒等功效，临床常用于治疗急性早幼粒细胞白血病等疾病[17]。现代药学研究结果显示，复方黄黛片的主要成分丹参总生物碱、雄黄水提取物及三氧化二砷，均能够有效抑制恶性肿瘤的新生血管作用，但关于该药物对原发性肝癌病灶血管生成作用的研究则尚未开展[18]。鉴于复方黄黛片具有较好的抗肿瘤及抑制血管新生作用的物质基础，笔者采用复方黄黛片治疗Solt-Farber原发性肝癌大鼠，期望为该药物的临床推广及肝癌的治疗提供一定依据。

本研究选用Solt-Farber二步法对大鼠进行原发性肝癌的造模[19]。首先利用二乙基亚硝胺攻击肝脏，造成肝细胞大量变性坏死，促进肝脏细胞的增生作用。随后采用2-AAF攻击增生作用下的肝细胞，进一步发挥其致癌效果。最后，采用肝部分切除术及注射骨髓干细胞可进一步加剧肝细胞的异常增生，造成肝细胞出现不受控制的增殖，并最后形成肝癌细胞。该方法具有造模成功率较高、大鼠死亡率较低等优点[20]。本研究中仅见少数大鼠死亡，且存活的所有大鼠均造模成功，进一步证实了该造模方法的可靠性。在本研究中，与模型组比较，高、中及低剂量组大鼠血清中AST、ALT及TBIL均明显降低，而病理组织学观察结果显示高、中及低剂量组大鼠肝组织癌变程度均不及模型组，且肝组织中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相对表达量均明显降低，表明复方黄黛片能够有效改善原发性肝癌大鼠肝脏功能、缓解由于恶性肿瘤所致肝脏病理学改变、抑制HIF-1α、VEGF及VEGFR-2等血管新生作用相关蛋白的表达，对于肝癌的治疗具有重要意义。

本研究发现，复方黄黛片对Solt-Farber二步法所诱导的原发性肝癌大鼠具有较好的治疗作用，其主要作用机制可能在于抑制肿瘤病灶的血管新生作用，值得进行深入研究。