黄芪多糖对人脐静脉内皮细胞的增殖及表达VEGF的影响

何丽红，郑 宣，莫佳航，许世超，方伟利，胡云根，全仁夫

黄芪多糖（astragaluspolysacharin，APS）是以黄芪干燥的根为原料提取的一种生物活性多糖，是黄芪主要的有效成分，有学者研究发现黄芪提取物具有很强的促血管再生作用[1]。APS对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖具有促进作用，研究发现APS在低浓度时可明显促进该细胞的增殖[2]。本实验研究了APS对HUVEC的细胞周期、凋亡及其对细胞增殖相关蛋白表达的影响，并从血管内皮新生的角度探讨了使用APS治疗缺血性疾病的机制，为使用APS促进组织再生及组织血管化提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人脐静脉内皮细胞系HUVEC，购自上海皓歌生物科技有限公司。用含10%胎牛血清（FBS）的M200培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d换液1次。

1.2 药物与试剂 APS（西安旭煌生物科技有限公司）；M200细胞培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），VEGF（杭州纽龙生物公司），鼠抗人VEGF单抗（Abcam），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（康成生物），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（碧云天生物），细胞周期检测试剂盒（碧云天生物）。

1.3 主要仪器 CO2培养箱（Thermo），荧光倒置显微镜（日本Nikon），流式细胞仪（美国BD公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.4 实验分组 对照组，0.1、1、10、50、100、200 μg/mL APS组，20 ng/mL VEGF组。

1.5 MTT法检测细胞增殖 HUVEC经PBS洗涤，消化，用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞记数，按每孔5×103/150 μL接种于96孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液，换上只含有0.5 %FBS的培养基预处理24 h，以达到细胞同步化。分别加入对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养12、24、36、48、72 h后，加入MTT溶液50 μL，使用酶标仪按MTT法测定各孔490 nm和690 nm的吸光度(OD值)。每组设3个复孔，至少重复三次实验。

1.6 细胞周期检测 釆用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数，按每孔1×105/2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液，换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h，以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，弃上清，加入1 mL预冷的70%乙醇，细胞吹打成单细胞悬液固定，4 ℃存放。PBS洗涤固定的细胞2次，2000 r/min离心5 min，加入PI染色液（终浓度为20 μg/mL）和RNaseA（终浓度为50 μg/mL），37 ℃避光染色30 min，上机前将细胞混匀，过200目尼龙网。30 min内上机检测。釆用美国BD公司生产的流式细胞仪进行DNA检测，激发波长480 nm，检测细胞周期分布情况。应用BD公司提供的相应软件程序进行数据处理。

1.7 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数，按每孔1×105/2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液，换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h，以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，收集1×106个各组细胞于离心管中。将细胞重悬于500 μL Buffer液中，分别加入5 μL PI和5 μL AnnexinV-FITC，室温避光孵育30 min后混匀转到流式管中用于检测。

1.8 细胞免疫荧光染色 HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数，按每孔1× 105/ 2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液，换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h，以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后，PBS清洗3次。4%多聚甲酸固定细胞60 min，PBS清洗3次。滴加5%正常山羊血清封闭30 min后直接滴加兔VEGF单克隆抗体(1∶100)，常温孵育90 min。PBS清洗3次后滴加FITC标记的山羊抗兔荧光二抗(1∶100)，室温避光孵育60 min。PBS清洗3次，滴加DAPI标记细胞核，室温避光孵育10 min。PBS清洗3次，直接荧光显微镜观察细胞绿色荧光的多少。DAPI标记细胞核，荧光显微镜观察为蓝色。

1.9 统计学分析 数据釆用SPSS18.0进行处理，计量资料釆用均数±标准差表示，采用Dunnett-t检验的方法对样本进行检验，检验结果服从正态分布，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 APS对HUVEC细胞增殖的影响 MTT法表明，APS在一定的范围内（0.1～100 μg/mL）能促进HUVEC细胞增殖，呈剂量依赖性。APS作用24、36、48、72 h后，该剂量范围组OD值均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。72 h后作用最为明显，100 μg/mL APS组较空白对照组细胞增殖率达158.80%，见图1。

图1 APS对HUVEC细胞增殖的影响

2.2 APS对HUVEC细胞周期的影响 流式细胞周期结果表明：APS组、VEGF组均能使HUVEC细胞周期G2/M期和S期比例增加。空白对照组G0/G1期，G2/M期和S期分别为50.67%、23.49%、10.21% 。随着APS浓度增加，G2/M期和S期的比例增加，10 μg/mL时与空白对照组相比即有统计学意义。G2/M期细胞的比例在APS浓度为100 μg/mL时达到峰值，G2/M期和S期分别为 40.67%和 13.01%。VEGF组作用24 h后，G0/G1期，G2/M期和S期分别为32.87%、40.67%和15.59%，与空白对照组有统计学差异。以上结果表明APS处理细胞后可以诱导细胞周期向G2/M期转变，见图2。2.3 检测细胞调亡 流式细胞仪检测细胞凋亡率如图3所示。APS组和VEGF组作用24 h后，对细胞凋亡有显著作用，但随着APS浓度的增加，并未显著增加细胞凋亡率。这些结果表明APS对HUVEC有较低毒性作用，APS浓度增加不会显著增加细胞毒性。

图2 流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24 h后的细胞周期

图3 流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24 h后的细胞凋亡情况

2.4 细胞免疫荧光染色 VEGF是HUVEC细胞特异性促增长因子，可显著促进HUVEC细胞形成血管网[3]。如图4所示，空白对照组HUVEC细胞仅少量表达VEGF。APS组、VEGF组均能刺激HUVEC细胞表达更多的VEGF。随着APS浓度的增加，VEGF表达量增加，并在100 μg/mL时VEGF表达量达到顶峰，约为空白对照组表达量的50倍，有显著统计学差异。100μg/mL APS组较空白组VEGF表达增加，比VEGF组表达量略低，是VEGF组VEGF表达量的88.9%。这些结果表明，APS可以促进HUVEC细胞表达VEGF，这对于HUVEC细胞早期血管化尤其重要。

3 讨论

诸多研究显示，血管内皮细胞对维持血管的正常功能以及血管新生有着重要作用，血管内皮细胞的增殖是血管新生发生的最根本和最重要的环节。内皮细胞生长因子是内皮细胞特异性的促血管化生长因子，可以特异性地作用于内皮细胞，促进新生内皮细胞的增殖、迁移和生存，增强内皮细胞的通透性，促进血管生成，对组织再生有多种生物学功效[4-5]。因此，本实验设VEGF为阳性对照组。

图4 荧光倒置显微镜检测HUVEC被相应处理24 h后的VEGF表达（×200）

黄芪，作为一种豆科黄芪属植物，药用其干燥根，是祖国医学中“干温补气”的重要中药。现代医学研究表明，黄芪具有多种功效。朱瑾波等[6]研究发现，黄芪对血管生成具有重要促进作用，推测黄芪可能通过促进内皮细胞的增殖和迁移而发挥作用。APS是黄芪的主要活性成分之一，姜琛璐等[7]总结了APS能够增强机体免疫功能，促进免疫器官的发育，还有抗病毒、抗肿瘤、改善心肌和肝脏损伤的重要作用。李绚等[8-9]研究发现APS具有降低血糖和保护血管的特殊作用。李悦山等[10]发现黄芪对人脐静脉内皮细胞增殖有促进作用，并能影响VEGF表达。刘洋等[11]发现APS对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。张小鸿等[12]发现黄芪及其有效成分可通过促进内皮细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进血管生成。樊炼等[13]学者发现APS能明显促进血管新生，其发生机制与VEGF及整合素蛋白αvβ3的表达相关。陈立新等[14]发现APS在一定浓度范围内可促进人心脏微血管内皮细胞的增殖。张玉影等[15]总结了APS对血管内皮细胞的作用研究进展，认为APS具有促血管内皮细胞生长的独特作用。

本实验发现APS在一定浓度范围内具有促进HUVEC增殖的作用，促进HUVEC细胞周期从G0/G1期向G2/M期和S期转变，并且与剂量呈正比，在100 μg/mL时达到最高。APS作用24h后，100 μg/mL组和VEGF组G2/M期和S期分别为40.67%和13.01%以及40.67%和15.59%，而空白对照组G2/M期和S期分别为23.49%和10.21%。且24 h作用后，流式细胞凋亡检测显示APS并未增加HUVEC凋亡率，APS促进内皮细胞增殖和血管化作用而不产生副作用。细胞免疫荧光染色实验结果表明，APS作用24 h后，HUVEC的VEGF表达也与APS剂量呈正相关，100 μg/mL APS促进HUVEC的VEGF表达明显高于空白对照组。200μg/mL时APS作用较100 μg/mL略下降，这一现象可能与APS浓度为200 μg/mL时出现的轻微细胞毒性有关。

以上研究结果证实APS能促进HUVEC细胞增殖，增加HUVEC细胞周期中G2/M期和S期的比例。同时APS可以上调HUVEC 中VEGF的表达，可以进一步促进新生血管的生成及组织血管化进程。通过探讨APS治疗缺血性疾病的机制，从而为组织再生、促进组织血管化提供实验依据。