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黄芪多糖对人脐静脉内皮细胞的增殖及表达VEGF的影响

2019-12-18何丽红莫佳航许世超方伟利胡云根全仁夫

中国中西医结合外科杂志 2019年6期
关键词:细胞周期空白对照内皮细胞

何丽红,郑 宣,莫佳航,许世超,方伟利,胡云根,全仁夫

黄芪多糖(astragaluspolysacharin,APS)是以黄芪干燥的根为原料提取的一种生物活性多糖,是黄芪主要的有效成分,有学者研究发现黄芪提取物具有很强的促血管再生作用[1]。APS对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖具有促进作用,研究发现APS在低浓度时可明显促进该细胞的增殖[2]。本实验研究了APS对HUVEC的细胞周期、凋亡及其对细胞增殖相关蛋白表达的影响,并从血管内皮新生的角度探讨了使用APS治疗缺血性疾病的机制,为使用APS促进组织再生及组织血管化提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人脐静脉内皮细胞系HUVEC,购自上海皓歌生物科技有限公司。用含10%胎牛血清(FBS)的M200培养基,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养,2~3 d换液1次。

1.2 药物与试剂 APS(西安旭煌生物科技有限公司);M200细胞培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),胰蛋白酶(美国Gibco公司),VEGF(杭州纽龙生物公司),鼠抗人VEGF单抗(Abcam),辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(康成生物),AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(碧云天生物),细胞周期检测试剂盒(碧云天生物)。

1.3 主要仪器 CO2培养箱(Thermo),荧光倒置显微镜(日本Nikon),流式细胞仪(美国BD公司),超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.4 实验分组 对照组,0.1、1、10、50、100、200 μg/mL APS组,20 ng/mL VEGF组。

1.5 MTT法检测细胞增殖 HUVEC经PBS洗涤,消化,用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞记数,按每孔5×103/150 μL接种于96孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液,换上只含有0.5 %FBS的培养基预处理24 h,以达到细胞同步化。分别加入对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养12、24、36、48、72 h后,加入MTT溶液50 μL,使用酶标仪按MTT法测定各孔490 nm和690 nm的吸光度(OD值)。每组设3个复孔,至少重复三次实验。

1.6 细胞周期检测 釆用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化,用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数,按每孔1×105/2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液,换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h,以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后,离心收集细胞,PBS洗涤2次,弃上清,加入1 mL预冷的70%乙醇,细胞吹打成单细胞悬液固定,4 ℃存放。PBS洗涤固定的细胞2次,2000 r/min离心5 min,加入PI染色液(终浓度为20 μg/mL)和RNaseA(终浓度为50 μg/mL),37 ℃避光染色30 min,上机前将细胞混匀,过200目尼龙网。30 min内上机检测。釆用美国BD公司生产的流式细胞仪进行DNA检测,激发波长480 nm,检测细胞周期分布情况。应用BD公司提供的相应软件程序进行数据处理。

1.7 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化,用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数,按每孔1×105/2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液,换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h,以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后,离心收集细胞,PBS洗涤2次,收集1×106个各组细胞于离心管中。将细胞重悬于500 μL Buffer液中,分别加入5 μL PI和5 μL AnnexinV-FITC,室温避光孵育30 min后混匀转到流式管中用于检测。

1.8 细胞免疫荧光染色 HUVEC经PBS洗涤、消化,用含0.5% FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞计数,按每孔1× 105/ 2 mL接种于6孔板。全培养基培养24 h后弃去培养液,换上只含有0.5% FBS的培养基预处理24 h,以达到细胞同步化。分别加入2 mL对照组、实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24 h后,PBS清洗3次。4%多聚甲酸固定细胞60 min,PBS清洗3次。滴加5%正常山羊血清封闭30 min后直接滴加兔VEGF单克隆抗体(1∶100),常温孵育90 min。PBS清洗3次后滴加FITC标记的山羊抗兔荧光二抗(1∶100),室温避光孵育60 min。PBS清洗3次,滴加DAPI标记细胞核,室温避光孵育10 min。PBS清洗3次,直接荧光显微镜观察细胞绿色荧光的多少。DAPI标记细胞核,荧光显微镜观察为蓝色。

1.9 统计学分析 数据釆用SPSS18.0进行处理,计量资料釆用均数±标准差表示,采用Dunnett-t检验的方法对样本进行检验,检验结果服从正态分布,P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 APS对HUVEC细胞增殖的影响 MTT法表明,APS在一定的范围内(0.1~100 μg/mL)能促进HUVEC细胞增殖,呈剂量依赖性。APS作用24、36、48、72 h后,该剂量范围组OD值均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。72 h后作用最为明显,100 μg/mL APS组较空白对照组细胞增殖率达158.80%,见图1。

图1 APS对HUVEC细胞增殖的影响

2.2 APS对HUVEC细胞周期的影响 流式细胞周期结果表明:APS组、VEGF组均能使HUVEC细胞周期G2/M期和S期比例增加。空白对照组G0/G1期,G2/M期和S期分别为50.67%、23.49%、10.21% 。随着APS浓度增加,G2/M期和S期的比例增加,10 μg/mL时与空白对照组相比即有统计学意义。G2/M期细胞的比例在APS浓度为100 μg/mL时达到峰值,G2/M期和S期分别为 40.67%和 13.01%。VEGF组作用24 h后,G0/G1期,G2/M期和S期分别为32.87%、40.67%和15.59%,与空白对照组有统计学差异。以上结果表明APS处理细胞后可以诱导细胞周期向G2/M期转变,见图2。2.3 检测细胞调亡 流式细胞仪检测细胞凋亡率如图3所示。APS组和VEGF组作用24 h后,对细胞凋亡有显著作用,但随着APS浓度的增加,并未显著增加细胞凋亡率。这些结果表明APS对HUVEC有较低毒性作用,APS浓度增加不会显著增加细胞毒性。

图2 流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24 h后的细胞周期

图3 流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24 h后的细胞凋亡情况

2.4 细胞免疫荧光染色 VEGF是HUVEC细胞特异性促增长因子,可显著促进HUVEC细胞形成血管网[3]。如图4所示,空白对照组HUVEC细胞仅少量表达VEGF。APS组、VEGF组均能刺激HUVEC细胞表达更多的VEGF。随着APS浓度的增加,VEGF表达量增加,并在100 μg/mL时VEGF表达量达到顶峰,约为空白对照组表达量的50倍,有显著统计学差异。100μg/mL APS组较空白组VEGF表达增加,比VEGF组表达量略低,是VEGF组VEGF表达量的88.9%。这些结果表明,APS可以促进HUVEC细胞表达VEGF,这对于HUVEC细胞早期血管化尤其重要。

3 讨论

诸多研究显示,血管内皮细胞对维持血管的正常功能以及血管新生有着重要作用,血管内皮细胞的增殖是血管新生发生的最根本和最重要的环节。内皮细胞生长因子是内皮细胞特异性的促血管化生长因子,可以特异性地作用于内皮细胞,促进新生内皮细胞的增殖、迁移和生存,增强内皮细胞的通透性,促进血管生成,对组织再生有多种生物学功效[4-5]。因此,本实验设VEGF为阳性对照组。

图4 荧光倒置显微镜检测HUVEC被相应处理24 h后的VEGF表达(×200)

黄芪,作为一种豆科黄芪属植物,药用其干燥根,是祖国医学中“干温补气”的重要中药。现代医学研究表明,黄芪具有多种功效。朱瑾波等[6]研究发现,黄芪对血管生成具有重要促进作用,推测黄芪可能通过促进内皮细胞的增殖和迁移而发挥作用。APS是黄芪的主要活性成分之一,姜琛璐等[7]总结了APS能够增强机体免疫功能,促进免疫器官的发育,还有抗病毒、抗肿瘤、改善心肌和肝脏损伤的重要作用。李绚等[8-9]研究发现APS具有降低血糖和保护血管的特殊作用。李悦山等[10]发现黄芪对人脐静脉内皮细胞增殖有促进作用,并能影响VEGF表达。刘洋等[11]发现APS对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。张小鸿等[12]发现黄芪及其有效成分可通过促进内皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进血管生成。樊炼等[13]学者发现APS能明显促进血管新生,其发生机制与VEGF及整合素蛋白αvβ3的表达相关。陈立新等[14]发现APS在一定浓度范围内可促进人心脏微血管内皮细胞的增殖。张玉影等[15]总结了APS对血管内皮细胞的作用研究进展,认为APS具有促血管内皮细胞生长的独特作用。

本实验发现APS在一定浓度范围内具有促进HUVEC增殖的作用,促进HUVEC细胞周期从G0/G1期向G2/M期和S期转变,并且与剂量呈正比,在100 μg/mL时达到最高。APS作用24h后,100 μg/mL组和VEGF组G2/M期和S期分别为40.67%和13.01%以及40.67%和15.59%,而空白对照组G2/M期和S期分别为23.49%和10.21%。且24 h作用后,流式细胞凋亡检测显示APS并未增加HUVEC凋亡率,APS促进内皮细胞增殖和血管化作用而不产生副作用。细胞免疫荧光染色实验结果表明,APS作用24 h后,HUVEC的VEGF表达也与APS剂量呈正相关,100 μg/mL APS促进HUVEC的VEGF表达明显高于空白对照组。200μg/mL时APS作用较100 μg/mL略下降,这一现象可能与APS浓度为200 μg/mL时出现的轻微细胞毒性有关。

以上研究结果证实APS能促进HUVEC细胞增殖,增加HUVEC细胞周期中G2/M期和S期的比例。同时APS可以上调HUVEC 中VEGF的表达,可以进一步促进新生血管的生成及组织血管化进程。通过探讨APS治疗缺血性疾病的机制,从而为组织再生、促进组织血管化提供实验依据。

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