bpV[phen]对小鼠行为学的影响*

丁继东，许文强，刘晓蕾，邹明新，时静华，邵 国

(1.内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院；3.内蒙古科技大学包头师范学院生物科学与技术学院)

1,10-邻菲啰啉[phen]是一种有机配体，与过氧化钒进行配位形成1,10邻二氮杂菲双过氧钒酸钾(bpV[phen])，具有治疗糖尿病和癌症等生物学功能[1]。pV[phen]是一种磷酸化酶抑制剂，可以影响众多细胞生理过程。bpV[phen]能增强神经营养因子活性，从而改善神经元的生存，研究发现注射bpV[phen]可减轻6-OH DA对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤[2]。

本课题组前期研究显示，bpV[phen]可以增加小鼠海马神经元细胞HT22中DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)的表达[3]，而DNMT3B在学习记忆中起重要作用[4]。有报道bpV[phen]可以通过影响神经元的凋亡从而影响动物学习记忆的能力[5-6]。本研究通过侧脑室注射，研究bpV[phen]对小鼠空间学习记忆能力(水迷宫)，伤害刺激回避反应能力(跳台实验)，条件主动回避能力(穿梭实验)和被动回避能力(避暗实验)的影响，探究bpV[phen]对小鼠不同行为能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 雄性ICR小鼠80只(6～8周)，18 g～22 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。

1.1.2试剂和设备 大脑立体定位仪和电动颅骨钻(瑞沃德生命科技有限公司)；ZS-OO1 Morris水迷宫分析系统、SDT-8跳台实验系统、STT-100穿梭实验系统、PAT-8避暗视频分析系统(成都泰盟软件有限公司)；手术器材和麻醉剂等其他设备和耗材均由包头医学院中心实验室提供。

1.2方法

1.2.1侧脑室药物注射 将小鼠随机分为PBS组和bpV[phen]组两组(40只/组)，分别进行侧脑室药物注射。bpV[phen]组缓慢注射5 μL的0.1 mg/mL的bpV[phen]溶液，PBS组注射等体积1 mol/L的PBS。

1.2.2行为学实验 将不同药物组小鼠再随机分为4组(n=10)，分别进行Morris水迷宫实验、跳台实验、穿梭实验和避暗实验。(1)Morris水迷宫实。水迷宫实验按文献方法进行[7]，连续学习4 d(定位航行实验)，记录小鼠寻找平台的潜伏期；隔天撤去平台进行最后的测试(空间探索实验)，记录小鼠90 s内目标象限穿越次数，计算目标象限内时间和路程占总时间和总路程的百分比。(2)跳台实验。将小鼠从跳台上放入实验箱中，自由活动2 min以适应环境。然后通过箱底部铜栅板给予电刺激(电击强度为36 V，50 Hz)，小鼠正常反应是跳回平台。多数小鼠会再次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台(记犯错1次)。每只小鼠训练5 min，记录犯错次数。24 h后重做试验，记录小鼠第1次跳下平台时间(潜伏期)和犯错次数。(3)穿梭实验。本实验进行3 d，第1 d为适应阶段，设置10次循环，第2 d为学习训练，第3 d为记忆测试，后两天都设置40次循环。将小鼠背对洞口置于1室，开始实验，系统通过红外线监测小鼠所在反应室，给予条件刺激灯光20 s，后10 s内同时给以电刺激(36 V，50 Hz)。如果在亮灯10 s内小鼠逃向安全区为主动回避反应(active avoidance response，AAR)，电击后才逃向安全区为被动回避反应(passive avoidance response，PAR)。在AAR和PAR刺激的过程中仍然停留在同侧箱中，则为逃避失败(escape failure，EF)。记录后两天小鼠的AAR次数、PAR次数、错误反应次数及主动回避反应潜伏期(Latency of active avoidance response，LAAR)。以AAR次数作为其学习记忆成绩的主要评价指标，并计算条件反应潜伏期平均时间。(4)避暗实验。实验分训练和测试两天。第1 d：训练前不通电，先让小鼠在明室和暗室之间自由穿梭，适应3 min以消除探究反射，一般小鼠会全部待在暗室；然后开始训练，关闭洞口，将小鼠重新放回明室，开始实验同时打开洞口，系统开始计时，当小鼠第一次全身进入暗室，计时停止，此即为步入潜伏期(step through latency,STL)，受电击(36 V，50 Hz)后逃出暗室(计犯错1次)，大多数小鼠会休息片刻后重新返回暗室，训练时间设为5 min，记录错误次数(error times，ETs)。训练时步入潜伏期大于3 min者弃用。训练完成24 h后将小鼠再次放入明室，记录其第一次进入暗室所需的时间，即步入潜伏期和5 min内错误次数。若5 min内小鼠未进入暗室则STL记为300 s，ETs记为0。

2 结果

2.1Morris水迷宫(测试空间学习记忆能力) 定位航行实验中，PBS组从第1 d(D1)到第4 d(D4)潜伏期呈变短趋势，提示小鼠学习了寻找平台的任务，而bpV[phen]组潜伏期则未呈递减趋势，D2、D3变短而第D4又变长，提示可能由于药物代谢，对学习记忆的影响降低；D2的bpV[phen]组潜伏期比PBS组短(P<0.05)，见图1-A。

空间探索实验中，与PBS组相比，bpV[phen]组小鼠目标象限穿越次数较多(P<0.05)；目标象限停留时间和行进路程百分比两项，两组之间比较无明显差异(P>0.05)，见图1-B。

图1 bpV[phen]对空间小鼠学习记忆的影响(*：P<0.05)

2.2跳台实验(测试对伤害性刺激的反应能力) 药物注射后，两组小鼠在D1时犯错次数无明显差异(P>0.05)；在D2时两组小鼠犯错次数较D1时均明显下降，差异有统计学意义，但两组间比较无明显差异(P>0.05)；在D3时而bpV[phen]组小鼠犯错次数高于PBS组，差异有统计学意义(P<0.05) 。见图2。

各组小鼠在D1时由于第1次受电击，潜伏期普遍较短，但D2时潜伏期明显延长(P<0.05)，D3时继续延长(P>0.05)。将D3时潜伏期作为小鼠记忆能力测试指标，bpV[phen]组小鼠潜伏期明显短于PBS组(P<0.05)。见表1。

图2 bpV对小鼠跳台错误次数的影响

表1 bpV对小鼠跳台潜伏期的影响(s)

a为与同组D1时比较，P<0.05；b为与同组D2时比较，P<0.05；c为与D3时PBS组比较，P<0.05

2.3穿梭实验(检测对主动回避能力的影响) 手术后24 h学习训练阶段，与PBS组相比，bpV[phen]组小鼠的犯错次数(EFs)明显少于PBS组(P<0.05)；其余各项两组间比较无明显差异(P>0.05)。见表2。

手术后48 h记忆测试阶段，PBS组和bpV[phen]组的PARs较学习训练阶段都下降(P<0.05)、两组AARs均上升(P<0.05)；两组EFs均明显降低(P<0.05)，且PBS组的EFs减少更明显(P<0.05)。见表2。

表2 bpV[phen]对小鼠穿梭实验的影响

a为在学习训练阶段与PBS组相比，P<0.05；b为与同组学习训练阶段相比，P<0.05；c为在记忆测试阶段与PBS组相比，P<0.05

2.4避暗实验(检测对被动回避能力的影响) 避暗实验3 d内每组的犯错次数呈减少趋势，提示小鼠完成了学习任务。D1时由于小鼠未经电击，在明室强光照射下很快进入暗室(潜伏期普遍极短)，当足部受到电击后返回明室；D3时潜伏期基本上达到设定的实验时间300 s，只有bpV[phen]组有个别小鼠进入暗室犯错，PBS组小鼠均待在明室，犯错次数为0。每天两组间组犯错次数比较，无统计学差异(P>0.05)。见图3。

图3 pV[phen]对小鼠避暗实验的影响

3 讨论

目前较常用的评价小鼠记忆能力的实验方法有Morris水迷宫实验、跳台实验、穿梭实验和避暗实验[8]。Morris水迷宫用于空间记忆功能评估[9]，跳台系统用于测试小鼠对伤害性刺激的记忆[10]，穿梭系统检测小鼠的条件主动学习记忆能力[11]，避暗实验检测的是小鼠对伤害性刺激的被动学习能力[12]。

有研究显示，表观遗传学在大脑中的海马组织参与信息贮存、学习记忆等重要功能，通过表观遗传学调节与学习记忆相关的基因表达的开启或关闭、增强或减弱，最终参与学习记忆的形成[13]。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，大脑中学习记忆相关基因的甲基化和去甲基化的变化可能在学习，记忆形成和行为可塑性方面发挥重要作用[14]。DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)调节，到目前为止，共有三种有甲基转移酶活力的DNMT被发现。本课题组前期研究显示，bpV[phen]可以增加小鼠海马神经元细胞HT22中DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)的表达[3]，因此bpV[phen]处理影响小鼠行为学可能与其对DNMT3B的影响有关。

不同的钒化物对行为学的影响可能有所差异。通过饮水使大鼠摄入钒化物后可以使钒化物在大鼠纹状体积累，增加纹状体内神经递质Ach、5-HT和GABA的水平并影响其相关的学习记忆[15]。而V2O5通过影响海马CA1脑区来损害了空间学习记忆[16]。本研究中发现bpV[phen]对空间学习记忆(水迷宫实验)，害伤性刺激(跳台实验)以及条件主动学习记忆(穿梭实验)均有影响，而对被动学习记忆测试(避暗实验)未见影响，提示bpV[phen]侧脑室注射对小鼠不同的行为有不同的影响。进一步明确其机制需从bpV[phen]在不同脑区的作用差异做进一步的研究。