酶及细胞固定化技术

郑雪凌 崔向珍

【摘要】酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。

【关键词】酶 细胞 固定化 载体 应用

酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。

所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。

一、固定化技术分类

1.吸附法

很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。

2.共價结合法

共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该法细胞与载体之间的连接键很牢固，使用过程中不会发生脱落，稳定性好，但反应条件激烈、操作复杂、控制条件苛刻。有人用此法将卡尔酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上，虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿酐酸的活性。利用此法制备的固定化细胞，细胞大多死亡。

3.交联法

交联法与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使细胞固定化。如采用戊二醛或偶联苯胺等带有两个以上的多功能团交联剂与细胞进行交联，可形成固定化细胞，但反应条件激烈，对细胞活性影响大。千烟一郎曾用此法制得具有天冬氨酸酶活力的固定化大肠杆菌细胞，也有人用此法制得具有葡萄糖异构酶活力的固定化细胞。

4.包埋法

包埋法是细胞固定化最常用的方法。按照包埋材料的结构可分为凝胶包埋和微胶囊包埋，即将细胞包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内。该方法操作简单，对细胞活性影响较小，制作的固定化细胞颗粒的强度较高，目前被广泛地用于废水处理。

四种固定化方法各有所长，其中包埋法是相对较好的一种方法，几种方法联用，往往效果更好。无论采用何种方法，固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。酶、载体及试剂的费用、操作难易等与工业化有关的因素也必须考虑。科研人员在研究时，应尽量选用价格低廉、易得的载体和试剂，载体最好是已在其他工业生产中大量使用的材料，同时也要考虑其应用时的安全性。

二、固定化细胞（酶）载体的特性

一种较为理想的固定化载体应满足5个要求：①固定化酶或细胞的活性回收率要高;②材料容易获得;③价格便宜;④操作制备方便，能适用于大规模生产;⑤有较高的机械强度，能较长时间使用和重复使用。目前所采用的固定化细胞（酶）载体主要有琼脂、明胶、海藻酸钠、硅藻土、聚乙烯醇，这5种载体的特性和差别主要有以下几个方面：

（1）在5种载体中，琼脂机械强度极差，实用性低。

（2）明胶强度较低，内部结构紧密，传质性能较差。

（3）海藻酸钠凝胶和聚乙烯醇凝胶机械强度较好。电镜观察表明内部呈多孔结构，对生物的毒性小，固定操作容易。两者比较，聚乙烯醇凝胶的机械强度优于海藻酸钠凝胶，但海藻酸钠凝胶的传质性能比聚乙烯醇凝胶好。

三、固定化技术的生物反应器

最简单的生物反应器为分批式反应器，制作这种反应器只需要加入游离酶或固定化酶（细胞），使之悬浮于搅拌罐中，而不需要支持性装置。反应结束后只需离心或过滤，便可从中分离出酶。这种反应器适合各种反应，设备成本低，但固定化酶（细胞）在回收过程中易损失，因此工业规模应用较少，对小规模试验合适。

另一种生物反应器是连续流反应器，即将粉状、块状固定化酶（细胞）制成酶（细胞）柱，通入底物溶液，产物便可连续流出。连续流反应器比分批式反应器工作固定，减少操作费用，易于自动控制和掌握产品的质量。

最新研制出了一种新型膜反应器。这种反应器应用一定的半透膜或超过滤膜，游离酶在膜的一侧或固定在膜上，酶反应可连续进行，反应产物通过半透膜滤去，消除了产物对酶反应的抑制，使酶反应不断沿着生成产物的方向进行，并且不需乳化便可进行两相反应。

四、展望

目前，固定化技术已在食品工业、精细化学品工业、医药等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。用固定化技术生产化工产品，条件温和，无三废产生，随着人类对环保的日益关注，固定化应用会更受关注，如何充分利用天然高分子载体，对其改性，或利用纳米技术、膜技术等来进行固定，必定会成为研究的热点。同时，开发新型、高效固定化反应器，进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点。而固定化酶（细胞）在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的进一步发展。

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