骨髓间充质干细胞保护阿霉素诱导的肾病综合征模型鼠肾小球的实验研究

黄青　凌志杰　邹毓华　钟小明　杨赟　张明海　罗开源

[摘要]目的 觀察骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对肾病综合征模型鼠肾小球的作用，探讨BMSCs保护肾病综合征模型鼠肾小球的可能性及其机制。方法 从SD大鼠骨髓中提取、分离、纯化、扩增和鉴定BMSCs。21日龄刚断奶的SD大鼠适应性喂养后，筛选尿蛋白浓度<0.8 g/L作为实验用鼠。随机选取5只实验用鼠作为正常对照称A组。其余实验鼠按照Bertani法尾静脉注射盐酸阿霉素制作肾病综合征模型鼠。成模后随机分成B、C和D组，每组5只，分别给予尾静脉注射生理盐水、泼尼松灌胃和尾静脉移植BMSCs细胞悬液。各组大鼠造模前、后，干预后1、4、8周分别进行24 h尿蛋白定量;干预结束后，处死各组实验鼠进行肾脏病理检查和nephrin、podocin mRNA的测定。结果 造模前，4个实验组的尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。造模后，B、C和D组的尿蛋白定量高于A组，差异有统计学意义（P<0.05），但B、C和D组内两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预后，B、C和D组的尿蛋白定量均高于同期A组，差异有统计学意义（P<0.05）;B、C和D组内两两比较：C、D两组的尿蛋白定量均低于同期B组，差异有统计学意义（P<0.05），但同期C、D两组的尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预结束后，在电镜下观察实验各组的肾脏损伤程度为B>C>D>A;B、C和D组的肾小球足细胞相关分子nephrin mRNA的表达均低于A组，差异有统计学意义（P<0.05），B、C和D组内两两比较：C、D组高于B组，差异有统计学意义（P<0.05），但C、D组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）;相关分子podocin mRNA的表达实验各组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 BMSCs移植可保护阿霉素诱导的肾病综合征模型鼠的肾小球损伤，其机制可能为通过上调肾小球足细胞的nephrin mRNA的表达减轻肾小球损伤和降低蛋白尿。

[关键词]骨髓间充质干细胞;肾病综合征;阿霉素;鼠;足细胞相关分子

[中图分类号] R332          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）10（b）-0016-06

[Abstract] Objective To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） transplantation on the glomeruli of model rats with nephrotic syndrome （NS）， and to explore the possibility and mechanism of BMSCs in protecting the glomeruli of model rats with NS. Methods The BMSCs were extracted， isolated， purified， amplified and identified form bone marrow of SD rats. After adaptive feeding of 21-day-old weaned SD rats， urinary protein concentration <0.8 g/L was selected as experimental rats. Five experimental rats were randomly selected as normal control named group A. The other experimental mice were injected with Adriamycin Hydrochloride into tail vein according to Bertani method to make NS model rats. After molding， the rats were randomly divided into group B， C and D， and each group had 5 rats， and each group was given saline by tail vein injection， Prednisone by stomach and BMSCs cell suspension by tail vein transplantation. Urinary protein was quantified 24 hours before and after the model establishment and 1， 4 and 8 weeks after the intervention. After the intervention， rats in each group were sacrificed for renal pathological examination and nephrin and podocin mRNA determination. Results There was no statistically significant difference in urinary protein quantitation among the four experimental groups before model establishment （P>0.05）. The urinary protein quantitation of group B， C and D was higher than that of group A after model establishment respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between groups B， C and D （P>0.05）. After intervention， the urinary protein quantitation of group B， C and D was higher than that of group A at the same time respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Two comparisons in group B， C and D： the urinary protein quantitation in group C and D was lower than that in group B at the same time respectively， with significant differences （P<0.05）， but there was no significant difference in the urinary protein quantitation between group C and D at the same time （P>0.05）. After the intervention， the degree of kidney injury in the experimental groups was B>C>D>A under electron microscope. The expression of nephrin in glomerular podocyte-related molecule in group B， C and D was lower than that in group A respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， two comparisons in group B， C and D： group C and D was higher than that of group B respectively， and the differences were statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between groups C and D （P>0.05）. There were no significant differences in the expression of podocin mRNA between experimental groups （P>0.05）. Conclusion BMSCs transplantation can protect the glomerular injury of model rats with Adriamycin-induced NS. The mechanism may be to reduce glomerular injury and proteinuria by up-regulating the expression of nephrin mRNA in glomerular podocytes.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells; Nephrotic syndrome; Adriamycin; Rat; Podocyte-associated molecules

肾病综合征（nehprotic syndrome，NS）是一种以大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和水肿为主要表现的临床综合征。NS多为原发性，发病机制尚不明确。目前的研究表明，免疫失调导致的肾小球足细胞损伤与NS发病密切相关[1]。NS多见于儿童及青少年，约80%为微小病变型[2]。微小病变型肾病综合征（minimal change nehprotic syndrome，MCNS）以弥漫性肾小球脏层上皮细胞足突消失或融合为主，目前临床上多采用以糖皮质激素为主的综合治疗。儿童正处于生长发育关键期，大量蛋白尿和长期服用激素等会影响患儿的生长发育和心身健康。此外，根据国际小儿肾脏研究组[3]报道约有20%的NS患儿可出现激素耐药表现。因此，探索一种安全有效的治疗方法已成为儿科临床亟待解决的問题。

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有增殖、分化、分泌和免疫调节等功能。近年来很多学者研究表明，BMSCs在损伤修复、再生、免疫调节等方面具有重要作用[4]。本研究采用体外扩增的大鼠BMSCs经尾静脉途径移植进入阿霉素诱导的MCNS鼠模型体内，观察蛋白尿和足细胞情况探索其疗效和机制。

1材料与方法

1.1实验动物

60～80 g和断奶日龄为21 d的雄SD大鼠均购于赣南医学院动物实验中心[SCXK（赣）2014-0001，清洁级]，实验中SD大鼠饲养和处置均符合实验动物伦理原则。

1.2主要仪器与试剂

主要仪器：流式细胞仪（COULERT，EPICS XL型），PCR仪（BIOER，FQD-48A）;主要试剂：大鼠淋巴细胞分离液（中国医学科学院，LTS1083P）、胎牛血清（Hycolne，SH30396.03）、DMEM-LG（Hycolne，SH30272.01），注射用盐酸阿霉素粉针剂10 mg（海正辉瑞制药有限公司，国药准字H33021980）、总RNA提取试剂盒Ⅱ （OMEGA，R6934-02），反转录试剂盒（Fermentas，K16 22），SYBR Green Ⅰ Realtime PCR试剂盒（Takala，208 054），2×PCR master mix（Fermentas，K0171）。

1.3 BMSCs提取、培养及鉴定

60～80 g雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，取出双股骨和胫骨。PBS冲洗骨髓腔，经大鼠淋巴细胞分离液分离单个核细胞。用贴壁法纯化培养BMSCs。培养基为含10 % 胎牛血清、100 U/L青、链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM-LG完全培养基。通过流式细胞术和诱导分化对BMSCs种子细胞进行鉴定。鉴定合格后种子细胞按梯度降温法进行冻存。待移植前，取出BMSCs种子细胞复苏后扩增培养。

1.4实验分组及处理

1.4.1造模  断奶日龄为21 d的雄性SD大鼠，体重为（40±8.5） g，适应性喂养7 d，测尿蛋白值<0.8 g/L者作为实验用鼠。随机抽取5只实验用鼠作为正常对照命名为A组，其余实验用鼠按Bertani法[5]进行造模。注射用盐酸阿霉素粉针剂10 mg，临时用生理盐水配成2 mg/ml的溶液，非麻醉下尾静脉一次性按7.5 mg/kg体重注射阿霉素，14 d后尿蛋白定量>30 mg/24 h表示造模成功，认定为NS模型鼠并随机分成B、C、D组，每组各5只。

1.4.2分组处理  将P4～P5代BMSCs，配成浓度约1×106个/ml的细胞悬液，在D（干细胞治疗）组大鼠成模后的第2天和第8天分别经尾静脉注射2 ml BMSCs悬液（约2×106个BMSCs）。与D组干预相同时间，A（正常对照）、B（空白对照）两组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水。C（激素治疗）组大鼠在成模后第2天开始按泼尼松5 mg/（kg·d）灌胃给药，连续给药8周。    1.5观察指标及检测方法

1.5.1尿蛋白定量及检测方法  将实验鼠置入代谢笼中，代谢笼下置干净空瓶。为防止尿液变质，空瓶中预先加入1 ml的甲醛。24 h后，收集尿液送检验科测量尿液总体积和尿蛋白浓度，计算得出24 h尿蛋白量。收集次数与时间：①第1次（造模前），购买回SD大鼠适应性培养第7天。②第2次（造模后），模型鼠注射阿霉素第14天。③第3次（干预后4周），以D（干细胞治疗）组首次干预后第4周。④第4次（干预后8周），以D（干细胞治疗）组首次干预后第8周。

1.5.2肾脏病理及检查方法  干预结束后，颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下快速取出双肾。其中左肾用无菌剪刀分成上下两份，上份经10%甲醛液固定，进行石蜡包埋、切片和六胺银染色，用于电镜观察。

1.5.3足细胞相关分子nephrin、podocin mRNA及检测方法  无菌取出的右肾，用剪刀分成约100 mg大小，立即置入液氮中用于RT-PCR。引物设计参照文献[6]，RNA提取、反转录和RT-PCR按照试剂盒说明书进行。

1.6统计学方法

数据采用SPSS 25.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间采用One-Way ANOVA和组内进行Bonferroni-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 BMSCs鉴定

2.1.1 BMSCs表型  P5代对数生长期的BMSCs经用流式细胞仪检测后，BMSCs表型CD90+、CD29+，CD45-、CD34-（图1），其中 CD90、CD29、CD45、CD34-阳性细胞群的荧光吸收峰分别为98.2%、99.1%、1.32%和1.01%。

2.1.2 BMSCs分化  成脂诱导2周后进行油红O染色，可见染成红色的脂肪细胞（图2）。成骨诱导3周后进行VonKossa染色，可见分化的成骨细胞包浆内有黑色物质沉淀物（图3）。

2.2实验各组造模前、造模后、干预后不同时间24 h尿蛋白定量的比较

造模前，4个实验组的尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。造模后，B、C和D组的尿蛋白定量均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05），但B、C和D组内两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预后1、4、8周，B、C和D组的尿蛋白定量均高于同期A组，差异有统计学意义（P<0.05）;B、C和D组内两两比较：C、D两组的尿蛋白定量均低于同期B组，差异有统计学意义（P<0.05），但同期C、D两组的蛋白尿定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.3肾脏病理

干预结束后，在电镜下观察各组肾脏病理结果：图4A为正常对照大鼠肾脏电镜下无明显异常，图4B为空白对照大鼠肾脏电镜下可见肾小球脏层足细胞明显空泡变性，系膜区可见较多电子致密物沉积，足突广泛融合（+++）。图4C为激素治疗组，电镜下肾小球脏层足细胞空泡变性较少，可见局灶节段性足细胞融合（+），系膜区少量电子致密沉淀物。图4D干细胞移植组，电镜下肾小球脏层足细胞空泡变性极少，可见局灶节段性足细胞融合（+），系膜区未见电子致密沉淀物。

2.4 足细胞相关分子nephrin、podocin mRNA表达

图5为足细胞相关分子nephrin、podocin mRNA Real time PCR电泳结果，图6为各基因采用2-△△Ct相对定量的方法进行统计结果。Ct值为定量PCR仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，△△Ct=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）正常对照组。采用2-△△Ct可以得到nephrin、podocin基因相对于β-actin基因的相对定量值。足细胞相关分子nephrin mRNA的表达B、C和D組均低于A组，差异有统计学意义（P<0.05）;B、C和D组内两两比较：C、D组均高于B组，差异有统计学意义（P<0.05），但C、D组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）;相关分子podocin mRNA的表达实验各组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

NS是儿童泌尿系统的常见病，多为原发性，以微小病变型居多。MCNS的光镜下肾小球基本正常，电镜下弥漫性肾小球脏层上皮细胞足突消失[7]。阿霉素诱导的肾病综合征鼠模型于1982年由Bertani等率先报道，具有造模简便、成功率高、稳定性好等优点，是公认较好MCNS鼠模型[8]。本实验采用Bertain法，尾静脉一次性大剂量（7.5 mg/kg）注射盐酸阿霉素进行造模，注射14 d后尿蛋白定量均>30 mg/24 h，成模率达100%。

BMSCs是骨髓来源的成体干细胞，具有干细胞的增殖、分化、旁分泌、免疫调节、低免疫源性和损伤修复等功能。本实验通过体外诱导培养BMSCs成功分化成骨细胞和脂肪细胞，这与文献[9]报道结果相符。此外，BMSCs还可分化为骨细胞[10]、软骨细胞[11]、神经细胞[12]等细胞。除了分化外，BMSCs还可分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、血管内皮生长因子等[13-16]。BMSCs具有取材方便，提取分离简单的优点，是目前研究最多的成体干细胞。Yang等[17]在BMSCS移植治疗局灶节段性肾小球硬化鼠模型的实验中发现：BMSCs移植可能通过上调MMP/TIMP和下调IL-6、TNF-α来降低尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平。Jiao等[18]在体内外实验中发现：BMSCs移植能通过激活Wnt/β-Catenin通路减少顺铂诱导的肾损伤。刘倩等[19]研究发现脂肪干细胞移植能减轻阿霉素诱导的肾病综合征鼠模型蛋白尿水平。

本研究中，造模前，4个实验组SD大鼠的尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。造模后，模型（B、C、D）组的尿蛋白定量明显高于正常对照（A）组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组组内比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预后1、4、8周，激素治疗（C）组和干细胞移植（D）组模型鼠尿蛋白水平低于空白对照（B）组，差异有统计学意义（P<0.05）;激素治疗组和干细胞移植组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示BMSCs移植能减轻阿霉素诱导的MCNS鼠模型蛋白尿。

MCNS蛋白尿的产生主要与肾小球滤过膜的结构与功能的受损有关。电镜下观察实验各组大鼠肾脏发现：正常对照组无明显异常;空白对照组肾小球脏层足细胞明显空泡变性，系膜区可见较多电子致密物沉积，足突广泛融合（+++）;激素治疗组肾小球足细胞少量空泡变性，可见局灶节段性足细胞融合（+），系膜区少量电子致密沉淀物。干细胞移植组肾小球脏层足细胞空泡变性极少，可见局灶节段性足细胞融合（+），系膜区未见电子致密沉淀物。病理结果表明：BMSCs移植能减轻阿霉素对肾脏的损伤。

肾小球足细胞及其足突间的裂孔隔膜是肾小球滤过膜的重要部分[20]。nephrin在肾脏中只表达于足细胞。nephrin蛋白是裂孔膜栅栏样结构的重要部分。nephrin分子胞外区与相邻足突nephrin分子交互形成滤过网，与裂孔隔膜一起阻止血浆蛋白漏入尿液中[21]。本课题组通过检测肾小球足细胞相关分子nephrin和nephrin mRNA的表达发现，模型组的肾小球足细胞相关分子nephrin mRNA的表达均低于正常对照组，差异有统计学意义。模型组组内比较干细胞治疗组和激素治疗组均高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），但干细胞移植组和激素治疗组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示阿霉素诱导能下调nephrin mRNA的表达，BMSCs移植可上调nephrin mRNA的表达。因此，本课题组认为，BMSCs可能通过上调nephrin mRNA的表达来减轻阿霉素对肾小球足细胞的损伤。

综上所述，BMSCs移植能保护阿霉素诱导的MCNS模型鼠的肾小球损伤。其可能机制为BMSCs通过上调nephrin mRNA的表达，减少足细胞空泡样变性和足突融合保护肾小球，从而降低蛋白尿水平。

[参考文献]

[1]李永珍，何庆南.原发性肾病综合征免疫发病机制研究进展[J].国际儿科学杂志，2016，43（1）：51-54.

[2]周帆.探讨微小病变型肾病综合征激素抵抗的相关危险因素[J].世界最新医学信息文摘，2016，16（39）：58-59.

[3]保睿，陈朝英.儿童原发性肾病综合征中microRNAs的研究进展[J].中国医刊，2018，53（8）：872-874.

[4]Alex S，Robert HM.MSC therapeutics in chronic inflam-mation[J].Curr Stem Cell Rep，2016，2（2）：168-173.

[5]Shailendra D，Praveen S.Stem cell biology：a new hope in regenerations and replenishments therapy[J].Ind J Clin Bio-chem，2018，33（4）：369-371.

[6]Guo JQ，Zou YH，Wu ZX，et al.Protective effects of mesen-chymal stromal cells on adriamycin-induced minimal change nephrotic syndrome in rats and possible mechanisms[J].Cytotherapy，2014，16（4）：471-484.

[7]单文婕，龚莹靓，朱亚菊.儿童肾病综合征肾组织病理免疫荧光分型和病理类型与激素疗效关系[J].临床儿科杂志，2017，25（2）：111-114.

[8]包玉龙，杨瑞，刘禾，等.阿霉素大鼠肾病综合征模型最佳剂量的筛选[J].动物医学进展，2018，39（5）：61-63.

[9]Zhang J，Jiang N，Yu H，et al.Requirement of TGFβ signaling for effect of fluoride on osteoblastic differentiation[J].Biol Trace Elem Res，2019，187（2）：492-498.

[10]Bai X，Li G，Zhao C，et al.BMP7 induces the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal cells into chondrocyte[J].Med Biol Eng Comput，2011，49（6）：687-692.

[11]Ruan H，Xiao R，Jiang X，et al.Biofunctionalized self-assembly of peptide amphiphile induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural cells[J].Mol Cell Biochem，2019，450（1-2）：199-207.

[12]Gao S，Zhao Z，Wu R，et al.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves radiation-induced heart injury through DNA damage repair in rat model[J].Radiat Environ Biophys，2017，56（1）：63-77.

[13]王劲，陈燕，王琳.骨髓间充质干细胞的旁分泌作用研究进展[J].中国小儿急救医学，2016，23（1）：57-61.

[14]Guo JQ，Gao X，Lin ZJ，et al.BMSCs reduce rat granulosa cell apoptosis induced by cisplatin and perimenopause[J]. BMC Cell Biology，2013，14：18.

[15]邱纪玲，王晓彤，周灏雯.间充质干细胞条件培养液修复多种疾病损伤的潜能[J].中国组织工程研究，2019，24（29）：4743-4748.

[16]李淑华，高丽莲，陈系古.表达肝细胞生长因子的大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞[J].中国病理生理杂志，2019，35（6）：1118-1123.

[17]Yang RC，Zhu XL，Wang J，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells attenuate the progression of focal segmental glomerulosclerosis in rat models[J].BMC Nephrology，2018， 19（1）：335.

[18]Jiao X，Cai J，Yu X，et al.Paracrine activation of the Wnt/β-Catenin pathway by bone marrow stem cell attenuates cisplatin-induced kidney injury[J].Cell Physiol Biochem，2017，44（5）：1980-1994.

[19]刘倩，张玉静，刘静.脂联素与鼠脂肪干细胞移植治疗大鼠肾病综合征[J].中国组织工程研究，2018，22（13）：2019-2113.

[20]Sooraj B，Saravanakumar M，Irene M，et al.The effects of sildenafil citrate on urinary podocin and nephrin mRNA expression in an L-NAME model of pre-eclampsia[J].Mol Cell Biochem，2017，427（1）：59-67.

[21]靳英丽，屈智慧，杨盼盼，等.槲皮素对糖尿病大鼠肾脏足细胞nephrin和podocin表达的影响[J].中国实验诊断学，2019，23（3）：519-522.

（收稿日期：2019-07-31  本文編辑：许俊琴）