姜黄素对人肺癌A549细胞增殖的影响及机制*

王林辉， 张雄， 陈慧勇， 杜日昌， 高双全， 张莹， 谭彩云

粤北人民医院 1病理科， 3胸外科(广东韶关 512026)； 2重庆医科大学基础医学院神经科学研究中心(重庆 400016)

非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)是肺癌最为常见的病理类型，由于NSCLC缺乏有效的早期诊断标记物，加之其淋巴结转移和远处器官转移早，病死率居高不下，因而研究在肺癌形成和发展过程中关键基因并寻找针对这些基因的药物可能对治疗NSCLC具有重要意义。整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过调节整合素以及整合素所介导的一些重要靶蛋白[1]或关键信号通路[2-3]，参与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润和转移等过程[4-5]。在肺癌中，ILK也发挥重要作用。Abd EI-Rehim等[6]对97例NSCLC患者的癌组织进行免疫组化检测发现，46.4%的病例存在ILK过度表达，且ILK的表达与NSCLC的病理分化、淋巴结转移和TNM分期密切相关。姜黄素是一种具有多种生物学活性的天然多酚类化合物，如抗炎[7]、抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、防治神经变性疾病[10]等。研究发现，姜黄素对肺癌也具有显著的抗癌效果[11-12]，但姜黄素是否可通过调节ILK的表达而发挥其抗癌效应却未见报道。因此，2018年11月至2019年6月，本研究以人肺癌A549细胞为研究对象，观察姜黄素对细胞增殖的影响并探讨其作用机制，为姜黄素防治肺癌的临床应用提供新的理论基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞 人非小细胞肺癌细胞A549购自中科院昆明细胞库(KCB200434YJ)。

1.2 主要试剂 姜黄素购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养液、胎牛血清、0.1%的胰蛋白酶消化液、青/链霉素、LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen Life公司、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录反应试剂盒、qRT-PCR试剂盒、蛋白提取试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒和SDS-Page胶配置试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人ILK、β-连环蛋白(β-catenin)、血管内皮生长因子(VEGF)抗体购自美国SantaCruz公司；内参抗体β-actin以及山羊抗兔的HRP-IgG二抗购自北京博鳌森生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Bio-rad公司。

1.3 药物配置 称取100 mg姜黄素，完全溶于DMSO中，加入三蒸水使其终浓度为1.0 mmol/L，过滤后置-20℃保存。

1.4 细胞培养 将冻存的人NSCLC细胞A549放入37℃恒温水浴锅中复苏，移入培养瓶中，用含10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM培养液，置入37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.5 MTT实验 取对数期生长的A549细胞充分吹打混匀制成单细胞悬液，按浓度为每孔1×105个接种于96孔板中；24 h后，待细胞充分贴壁后，加入5、10、20、40 μmol/L不同浓度的姜黄素，作用不同的时间(24、48、72 h)；并设置空白对照组和溶剂DMSO对照组，且每组设置复孔4个。在不同时间点，加入5 mg/mL的MTT液20 μL，继续培养4 h后，加入150 μL/孔的DMSO液终止培养。充分振荡混匀后，采用酶标仪读取A490nm。细胞增殖抑制率(%)=1-试验组A490/空白对照组A490。

1.6 细胞转染 待细胞贴壁生长至90%后开始转染。首先准备2个EP管，取出一个加入0.75 mL的无血清无抗生素的培养基，并往其中加入8 μg的质粒pcDNA3.1或pcDNA3.1-ILK(由上海吉凯基因设计并合成)，充分混匀；另一个EP管加入0.75 mL无血清无抗生素培养液，并加入30 μL的 LipofectamineTM2000；将2个EP管内的液体充分混匀后静止20 min，然后加入培养瓶中继续培养6 h；弃培养液并更换正常的培养液(含血清和抗生素)，继续培养。

1.7 Realtime-PCR 收集各组细胞，并根据RNA提取试剂盒说明提取各组细胞的总RNA，并测定RNA浓度。按照逆转录反应试剂盒操作合成cDNA，然后再按照qRT-PCR试剂盒说明书操作步骤检测ILK、β-catenin和VEGF的相对表达水平。实验重复进行3次。

1.8 Western blot 收集各组细胞，加入100 μL蛋白裂解液，冰上孵育20 min，离心后收集上清。采用Bradford法检测蛋白浓度。将20 μL蛋白样品上样后，SDS-PAGE胶电泳分离后，切胶、转膜，并用含0.5 g/L脱脂奶粉TBST液室温封闭1 h，加入抗体ILK(1∶200)、anti-β-catenin(1∶200)、anti-VEGF(1∶200)和β-actin抗体(1∶5 000)，4℃孵育过夜；用TBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)，室温孵育2 h，ECL法显影，并用凝胶化学成像分析仪记录其OD值。

2 结果

2.1 姜黄素对人肺癌A549细胞增殖的影响 与空白对照组比较，A549细胞的增殖抑制率在DMSO对照组和5 μmol/L的姜黄素处理24 h时，差异无统计学意义(P>0.05)；当姜黄素浓度增加至10、20和40 μmol/L作用24 h后，细胞的增殖抑制率明显增加(P<0.01)，且随着浓度的增加而更加明显(P<0.01)。结果还显示，当姜黄素浓度为5 μmol/L作用A549细胞48和72 h后，此时姜黄素对癌细胞的抑制率与作用24 h的抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。当姜黄素浓度增加到10、20、40 μmol/L后，作用48和72 h时的抑制率与作用该细胞24 h时比较，有显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、表1。

*与空白对照组比较P<0.01； #与处理24 h比较P<0.01

项目24 h48 h72 h空白对照组0.7±0.11.3±0.21.4±0.2DMSO对照组1.2±0.12.1±0.22.4±0.2姜黄素5 μmol/L组2.4±0.22.8±0.53.1±0.4姜黄素10 μmol/L组12.9±2.3∗24.3±3.8∗41.7±4.9∗姜黄素20 μmol/L组22.9±4.1∗△38.4±7.2∗△45.7±6.5∗△姜黄素40 μmol/L组39.8±3.5∗△49.6±7.4∗△62.1±4.8∗△

*与空白对照组比较P<0.01; △与姜黄素10 μmol/L组比较P<0.01

2.2 姜黄素对A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF基因和蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，DMSO对照组和5 μmol/L姜黄素处理24 h时A549细胞内的ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；而当姜黄素增至20 μmol/L后，细胞内的ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

组别基因蛋白ILKβ-cateninVEGFILKβ-cateninVEGF空白对照组45.9±5.142.6±2.387.4±6.544.6±3.837.5±3.686.3±5.8DMSO对照组44.6±4.741.8±3.586.3±5.846.8±4.536.7±4.285.9±6.1姜黄素5 μmol/L组43.7±3.439.6±4.183.1±6.143.4±5.135.2±3.683.4±6.3姜黄素20 μmol/L组27.6±2.9∗24.3±5.6∗47.2±5.4∗27.5±3.418.9±2.742.1±2.9

*与空白对照组比较P<0.01

2.3 过表达ILK对姜黄素作用的影响

2.3.1 转染pcDNA3.1-ILK后对细胞内ILK的表达的影响 与空白对照(42.5±3.8)比较，转染pcDNA3.1后，A549细胞内的ILK的蛋白表达水平为39.8±5.1，差异无统计学意义(P>0.05)；转染了pcDNA3.1-ILK后，可以见到细胞内的ILK的蛋白含量达68.2±4.7，显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.3.2 过表达ILK后对姜黄素抑制A549细胞增殖的影响 空白对照组和DMSO对照组细胞增殖的抑制率均很低(0.2%)。与20 μmol/L姜黄素处理24 h时[(22.9±2.3)%]比较，转染pcDNA3.1组细胞增殖抑制率为(23.4±1.8)%，差异无统计学意义(P>0.05)；当转染了pcDNA3.1-ILK后，A549细胞的增殖明显增强，即姜黄素对癌细胞的抑制率明显减少，达到(14.7±1.2)%，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

A：不同浓度姜黄素作用24 h后对A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达水平的影响； B：ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达水平的光密度值的比较。*与空白对照组比较P<0.01

图2姜黄素对A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达的影响

A：转染pcDNA3.1-ILK 后，A549细胞内ILK蛋白表达的情况； B：转然后，ILK蛋白表达的相对光密度值的比较。*与空白对照组比较P<0.01

图3转染pcDNA3.1-ILK后对A549细胞内ILK蛋白表达的影响

*与姜黄素处理组比较P<0.01

2.3.3 过表达ILK后对姜黄素抑制A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF mRNA和蛋白表达的影响 与20 μmol/L姜黄素处理24 h时比较，姜黄素+pcDNA 3.1 组细胞内的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；而在姜黄素+pcDNA3.1-ILK组，细胞内的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表达水平则有显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、4和图5。

组别ILKβ-cateninVEGF20 μmol/L组姜黄素29.6±3.825.7±2.445.9±5.2pcDNA+姜黄素组28.7±4.124.8±3.746.5±6.6pcDNA-ILK+姜黄素组42.1±3.7∗40.8±5.3∗76.2±6.0∗

*与20 μmol/L姜黄素组比较P<0.01

组别ILKβ-cateninVEGF20 μmol/L姜黄素组23.5±3.221.4±2.735.9±4.8姜黄素+pcDNA3.1组24.1±1.925.6±3.438.4±5.3姜黄素+pcDNA3.1-ILK组52.7±6.5∗40.6±2.6∗80.6±8.1∗

*与20 μmol/L姜黄素组比较P<0.01

A：过表达ILK对姜黄素作用的A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达的影响； B：ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达的相对光密度值的比较。*与20 μmol/L姜黄素比较P<0.01

图5过表达ILK对姜黄素抑制A549细胞内ILK、β-catenin和VEGF蛋白表达的影响

3 讨论

肺癌是发病率和病死率都增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其中80%～85%的患者属于NSCLC。NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。与小细胞癌相比，NSCLC的生长速度相对较慢，转移时间相对较晚。在NSCLC的治疗中，常规的化疗药物不仅价格昂贵，而且往往容易产生耐药性，且长时间大剂量的用药会给患者带来严重的不良反应；而另一种疗法-放疗仍然会给患者带来巨大的不良反应，严重影响患者的生活质量和生存率。因此，寻找具有高效抗瘤活性且无(小)不良反应的新型药物是目前肿瘤研究领域的热点，而从天然的植物、中草药中提取的有效的抗肿瘤成分就受到了广泛关注。

姜黄素是从多种中药根茎中提取的一种多酚类化合物。姜黄素拥有广泛的生物学活性，抗肿瘤活性也包含在内。研究也证实，姜黄素对肺癌，特别是NSCLC有显著的抑制作用，其机制多涉及了姜黄素的抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞的自噬性死亡等。在本研究中，运用MTT检测姜黄素对人NSCLC A549增殖的影响，结果显示了姜黄素可显著抑制癌细胞的增殖，且呈浓度-时间依赖性，这也与Cai等[13]研究结果相一致。

姜黄素拥有广泛生物学活性的原因是因为姜黄素拥有多类生物学靶点，比如：转录因子类，核因子-κB(NF-κB)、低氧诱导因子-1(HIF-1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、过氧化物酶体增殖物激活受体r(PPARr)等；炎症因子类，IL-1、IL-2、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)等；酶类，环氧化酶-2(COX-2)、ATP激酶(ATPase)、血红素加氧酶-1(HO-1)等；激酶类，EGFR激酶、AMPK、Akt等[14]。ILK是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，主要分布于胞浆内，其过度表达直接参与了多种恶性肿瘤的发生发展、浸润转移和临床预后等过程，被认为是一种新型的癌基因。研究结果已经证实利用siRNA-ILK[15]或ILK的小分子抑制剂[16]可促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的浸润和转移，因此，有学者认为ILK可作为人类癌症的生物标记物和治疗的一个潜在靶点[17]。本研究运用 Western blot检测了姜黄素对A549细胞中ILK表达的影响，发现姜黄素可降低ILK mRNA和蛋白的表达；当过表达ILK后，肺癌细胞的增殖力又明显增强，且细胞内的ILK mRNA和蛋白表达也显著增加。可见，过表达ILK逆转了姜黄素对肺癌细胞A549增殖和细胞内ILK mRNA和蛋白的抑制作用。

研究证实，Wnt/β-catenin是ILK介导的下游重要的通路之一[18]，而β-catenin是Wnt/β-catenin中最为重要的组成部分，主要存在于胞浆中。当Wnt通路异常激活后，胞浆内的β-catenin就会大量聚集，然后移入核内，激活转录因子，从而促进细胞的增殖、迁移等过程。因此，β-catenin在胞浆内浓度决定了Wnt通路的开放与关闭，也被认为是参与恶性肿瘤发生、发展的重要因素[19]。研究也表明，姜黄素可通过抑制Wnt/β-catenin抑制NSCLC或肺癌干细胞的增殖[20-21]，但具体的作用环节却不清。而本研究结果显示，姜黄素可抑制NSCLC A549细胞内β-catenin的mRNA和蛋白水平的表达；而过表达ILK后，肺癌细胞内的β-catenin的基因和蛋白水平又明显增强。

恶性肿瘤的生长、转移都离不开新生的血管。新生的血管不仅为肿瘤带来生长所需的氧气和营养物质，带走代谢废物；而且还为肿瘤的侵袭和转移提供必要的物质条件。血管的生成离不开体内生长因子、信号通路的调节，其中作用最强、影响最大的就是VEGF。研究已经证实了VEGF是Wnt/β-catenin通路中β-catenin进入核内激活转录的重要靶基因[22]。VEGF表达越高，则提示恶性肿瘤侵袭能力越强，促血管生成的作用也显著，浸润和转移则越早；干预VEGF的生成及其作用或阻断VEGF与其受体的结合则可抑制肺癌的血管生成，从而抑制生长、浸润和转移[23-24]。本研究结果表明，姜黄素可抑制VEGF mRNA和蛋白的表达；而过表达ILK后，VEGF mRNA和蛋白的表达又明显提高。

综上所述，本研究结果表明，姜黄素可通过下调ILK的表达抑制A549细胞的增殖，其机制可能是：下调ILK使Wnt/β-catenin信号通路失活，使得β-catenin的表达减少，进而抑制下游靶基因VEGF的表达，最终抑制癌细胞增殖。本实验探讨了姜黄素抑制人NSCLC细胞生长增殖的作用机制，为姜黄素防治NSCLC提供了新的实验依据，体内实验需进一步开展。