绵羊MAVS基因的原核表达及多克隆抗体的制备

董丹丹，刘 腾，缪秋红，朱 杰，刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）又称IPS-1（interferon-Β）[1]、VISA（virus-induced signaling adaptor）[2]、Cardif（CARD adaptor inducing interferon-Β）[3]。MAVS在天然免疫中至关重要，主要介导下游 NF-κB 等因子的激活以应对病毒感染。人源MAVS的mRNA含有两个剪接体，长度分别为3.4 kb和9.5 kb。MAVS含有540个氨基酸，可分为三部分：N端CARD样结构域（半胱天冬酶募集结构域caspase recruitment domain）、脯氨酸富集结构域和C端的跨膜结构域[4]。Seth等[5]2005年首次证实MAVS可以介导由病毒感染引起的NF-kappaB和IRF3的激活，从而诱导机体的免疫应答，并进一步证明NF-kappaB和 IRF 3的磷酸化需要MAVS。Moore等[6]2008年证实NLRX1可以拮抗MAVS介导的机体免疫应答。

小反刍兽疫病毒是由PPRV引起的一种急性、高传染性疾病，主要感染绵羊和山羊[7]。由于小反刍兽疫对养殖业产生了巨大的经济损失，现已成为全球根除目标之一[8]。为了进一步研究MAVS能否应对PPRV引起的病毒感染，本研究对绵羊MAVS基因进行克隆并构建原核表达载体，通过纯化蛋白并免疫小鼠制备抗MAVS基因的多抗，为进一步研究MAVS与PPRV之间的相互作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒和菌株感受态细胞DH5α、BL21购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体pET-32a、真核表达载体pCMV-myc及绵羊肺细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂LATaq聚合酶、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；pMD19T载体、SolutionⅠ连接酶、XhoⅠ和EcoR V限制性内切酶购自NEB公司；质粒小提试剂盒购自 AXYGEN 公司；抗His 标签鼠单克隆抗体购自北京康为世纪公司；ECL化学发光试剂盒购自 Thermo 公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 羊MAVS基因的克隆根据NCBI数据库中MAVS基因序列（登录号：XM_015099722.1）设计PCR引物，上游引物MAVS-F：5'-GATATCATGACGTT TGCCGAGGACAGA-3'（下划线部分为EcoR V 酶切位点），下游引物MAVS-R：5'-CCGCTCGAGT CACTGGGGTAGGCGCCGCCGGTACAG-3'（下划线部分为XhoⅠ 酶切位点），产物长度为1569 bp，共编码523个氨基酸。引物由上海华津科技有限公司合成。

利用Trizol法提取绵羊肺细胞的总RNA，经反转录获得cDNA，以此为模板扩增MAVS基因。将扩增产物纯化后连接至pMD19-T 载体，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆测序。

PCR反应体系：模板 DNA（50 ng/ μL）2 μL，ExTaqMix 25 μL，上下游引物（10 mmol/L）各2 μL，补加灭菌蒸馏水至50 μL。PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min 45 s，34 个循环；72℃再延伸5 min。

1.4 原核表达重组质粒的构建与鉴定将成功连接pMD19-T 载体并测序正确的菌液扩大培养，经质粒小提试剂盒提取质粒。将质粒进行双酶切后连接至原核表达载体pET-32a及真核表达载体pCMV-myc，菌液鉴定后送去测序。

1.5 重组质粒的原核表达将pET-32a-MAVS转化至BL21感受肽细胞，经抗性筛选后挑取单个菌落于氨苄抗性LB中，37℃ 220 r/min摇床培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG，然后置于16℃摇床继续震荡培养20 h。将菌液离心后，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。

1.6 目的蛋白的纯化扩大培养的菌液经IPTG诱导20 h后离心，弃上清液，用PBS洗涤沉淀，室温离心30 min后再次弃去上清，用PBS将沉淀重悬后-80℃反复冻融3次。将菌液进行超声破碎，工作电压为300 V，工作 5 s，间隔 9 s，超声至菌液不黏稠。将菌液反复冻融3次，离心后弃上清。用含2 mol/L尿素的Tris缓冲液（50 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCL、0.5% Triton X-100，pH 8.0）洗涤包涵体，10 000×g离心30 min后弃上清，重复操作 2 次。洗涤沉淀，10 000×g离心30 min后弃上清，重复2次。用含8 mol/L尿素的Tris缓冲液溶解沉淀（4 mL/g），4℃过夜，次日12 000×g离心10 min，将上清加入透析袋中，分别用含6、5、4、3、2 mol/ L尿素进行梯度复性[9]。

1.7 羊MAVS多克隆抗体的制备用纯化的MAVS重组蛋白免疫6周龄BALB/ c SPF 雌鼠，首免时将弗氏完全佐剂与蛋白混匀后多点皮下注射小鼠背部，免疫剂量为50 μg/只。2周和4周后分别进行二免和三免，将弗氏不完全佐剂与蛋白混匀后多点皮下注射小鼠背部，免疫剂量同上。三免7 d后眼眶采血并分离血清。

1.8 多克隆抗体特异性检测将真核表达质粒 pCMV-myc-MAVS转染CV细胞，48 h后收集蛋白样品，100℃煮样10 min后进行SDS- PAGE 电泳，转印至PVDF膜上，然后用5%脱脂乳室温封闭2 h，以制备的多抗（1∶200）作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG（1∶10000）作为二抗进行Western blot检测。

2 结果

2.1 MAVS基因的克隆提取绵羊肺细胞RNA并将其反转录后作为模板，成功扩增出MAVS基因，大小约1569 bp（图1），与预期条带大小相符，经测序后确认无碱基突变。

图1 MAVS基因的 PCR 扩增Fig.1 Amplification results of MAVS

2.2 重组表达质粒的鉴定pET-32a-MAVS 经EcoR V 和XhoⅠ双酶切，电泳结果显示有两条特异性条带，分别为载体和目的基因（图2），表明MAVS基因插入到原核表达载体pET-32a中，测序结果显示无碱基突变。

2.3 MAVS蛋白鉴定及可溶性分析SDS-PAGE电泳结果表明，重组质粒pET-32a -MAVS转化至BL21感受态细胞后，经IPTG诱导成功表达目的蛋白，MAVS融合蛋白大小为95 kDa（图 3A），与预期相符。未诱导的重组质粒及诱导的空载体质粒无目的蛋白表达。Western blot显示MAVS重组蛋白主要以包涵体形式表达（图 3B）。

2.4 重组MAVS蛋白多克隆抗体的 Western blot分析转染真核表达质粒pCMV-myc-MAVS，48 h后收取细胞裂解液进行Western blot，将制备的多克隆抗体作为一抗。结果显示95 kDa处出现目的条带，表明制备的抗体可与 MAVS蛋白反应，并具有良好的特异性（图4）。

图2 重组表达质粒 pET-32a-MAVS的双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-32a-MAVS digested with double enzymes

图3 MAVS 蛋白鉴定及可溶性分析Fig.3 Identification and soluble analysis of MAVS protein

图4 纯化的 MAVS重组蛋白分析Fig.4 Purified MAVS recombinant protein

3 讨论

MAVS是线粒体外膜上的一种接头蛋白，可激活天然免疫信号通路并诱导干扰素表达， 参与抗病毒免疫反应。当RNA病毒感染细胞后，胞质中的RIG I受体可识别并结合MAVS，促使其发生寡聚化，产生I型干扰素及促炎性细胞因子。虽然MAVS在抗病毒天然免疫中发挥至关重要的作用，但病毒也会形成各种各样的拮抗机制[10]。研究表明，汉坦病毒的糖蛋白片段能阻止IRF3磷酸化，进而抑制RIG I/MAVS/TBK1/TRAF3信号通路，通过减少IFNβ的产生使其在人内源细胞中成功复制[11]。丙肝病毒的NS3/4A可将MAVS切割，使其不能激活下游信号，从而阻断RLR介导的信号通路[12,13]。甲肝病毒3ABC（3Cpro 半胱氨酸蛋白酶的前体）及乙肝病毒X 蛋白HBX 也可裂解MAVS，从而阻断信号转导。由此可见，MAVS在抗病毒免疫反应中起着关键作用，深入研究MAVS的功能有助于了解宿主与病毒的相互作用机制。

本研究成功制备了反应良好的羊MAVS多克隆抗体，为研究其生物学功能及小反刍兽疫病毒的致病机制提供了平台，也为深入研究相关的免疫信号通路，以及小反刍兽疫病毒逃逸宿主天然免疫的机制研究打下基础。