基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建

龙欢 赵辉 王绪朋 贾瑞宗 贺萍萍 孔华 郭运玲 郭安平

1. 海南大学热带农林学院，海南海口  570228;2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口  571101;3. 海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室，海南海口  571101

摘  要  双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点，一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高，见效低，而且还可能对环境造成负面影响，因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术，设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达，48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现，定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。

关键词  基因编辑;曲叶病毒;番木瓜;瞬时表达中图分类号  Q949.759.6      文献标识码  A

Construction of CRISPR Plant Expression Vectors Resistant to Papaya Leaf Curl Virus

LONG huan^1，2， ZHAO Hui^1，2*， WANG Xupeng²， JIA Ruizong^1，2， HE Pingping^1，2， KONG Hua^1，2，GUO Yunling^1，2， GUO Anping^1，2**

1. Institute of Tropical Agricultural and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  The Geminivirus are characterized by strong destructiveness， diverse hosts， and wide geographical distribution. They have always been a major problem in the crop production of the world . The use of physical and chemical methods to control them is not only costly， but also has low efficacy， and may also have a negative impact on the environment. Therefore， it is one of the effective ways to cultivate disease-resistant varieties by molecular breeding technology. The CRISPR/Cas9 gene editing technology and Golden Gate cloning technology were used to design and construct a gene editing multi-cut expression vector resistant to papaya leaf curl virus. The vector was transferred into Agrobacterium tumefaciens AGL1 and injected into the tobacco leaves for transient expression. After 48 h， the presence of green fluorescence was observed by a laser confocal microscopy. It was located in the nucleus and cytoplasmic membrane. The work would provide a theoretical basis for the study of papaya leaf curl virus.

Keywords  genome editing; leaf curl virus; papaya; transient expression

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.015

番木瓜（Carica papayaL.）是熱带地区最重要的消费和出口热带水果之一。目前从番木瓜上发现的病毒大多以番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）和番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus， PLDMV）为主，均为RNA病毒^[1]，近期，项目组从海南地区番木瓜叶片上分离出番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl virus， PaLCV），得病植株表现出植株矮小，叶柄卷曲，叶片皱缩失绿等现象，严重时植株绝产死亡。本研究利用最新的基因编辑手段，从病毒本身基因入手，力图通过给番木瓜建立CRISPR免疫系统，来提高番木瓜对该类病毒的抗病性。

CRISPR基因编辑技术作为第3代基因编辑工具，是新型的分子育种技术，由于剪切位点的效率与剪切位点的碱基结合效率直接相关，与目标基因功能无直接关系，该技术简单易懂，适用性强，无论在植物基因编辑或是外抗外源病毒方面，都获得广泛关注和取得可喜的突破，在对抗双生科曲叶病毒方面，前期可通过基因序列分析系统以及靶点评估系统筛选出在理论上能高效剪切DNA序列的sgRNA剪切位点，后期利用农杆菌转化植物愈伤组织的方法可以培育出抗曲叶病毒的阳性转基因植物苗，在植物细胞内可得到Cas9和sgRNA的稳定表达，并形成sgRNA-Cas9的复合体。当双生科病毒感染植物时，病毒ssDNA会被释放到植物细胞内，随后ssDNA会通过自身滚环复制形成无数个dsDNA拷贝。此时，sgRNA-Cas9复合体会自动识别病毒dsDNA的特定序列并对双链DNA进行剪切，造成病毒DNA的双键断裂，断裂后的序列会通过非同源性末端连接进行修复或造成病毒基因的降解^[2]。在目前所发表的研究成果中，中科院遗传与发育研究所Ji等^[3]利用CRISPR/Cas9系统证明该系统可成功编辑甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus， BSCTV），所选用的植株为本氏烟和拟南芥，首先利用瞬时表达体系筛选出高效的sgRNA切点，随后在转化水平上实现最终对甜菜严重曲顶病毒的抗性，从基因靶点的突变证据可说明该系统可以特异性切割目标病毒DNA。明尼苏达大学Baltes等^[4]用能表达荧光蛋白GFP的基因对菜豆黄矮病毒序列进行改造，运用高通量测序、荧光强度分析等进行效率分析，无论是从瞬时表达水平还是从遗传转化层面，都能证明该系统能有效编辑病毒DNA，显著降低病毒积累量。与此同时，阿卜杜拉国外科技大学Ali等^[5]也成功运用该系统实现对番茄黄化曲叶病毒进行高效编辑。以上研究都能有效阻止目标病毒的积累复制，说明CRISPR系统在对抗双生科DNA病毒方面具有可行性。

Golden Gate克隆技术是基于ⅡS酶识别序列位置和切割序列位置不一样的特点，首先ⅡS型核酸内切酶在识别DNA序列后会在识别位点之外切割DNA，然后产生黏性末端DNA片段，最后通过DNA连接酶可以将DNA片段按照特定的顺序相连，连接好的片段不含使用过的ⅡS型核酸内切酶识别位点^[6-9]，该方法简单易懂，操作方便，通过该方法构建载体只需一步法就可以完成构建。为了达到广谱高效的抗病效果，本研究结合CRISPR多切点载体技术、Golden Gate载体构建技术、借鉴前人对抗双生科曲叶病毒的研究^[2]，以及对该病毒海南株系的测序和生物信息学分析等，选择了病毒DNA-A基因组基因间区IR、编码外壳蛋白基因和移动蛋白基因共同区AV1/AV2，编码复制相关蛋白基因和AC4蛋白基因AC1/AC4，共3个病毒关键位点进行串联的剪切设计，同时在植物表达载体的引导序列后引入一段荧光蛋白基因，通过荧光蛋白的瞬时表达，以验证载体在烟草细胞的定位情况。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  菌株与载体  大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。农杆菌AGL1化学感受态细胞购自北京天恩泽基因科技有限公司。载体pMOD_A0101、pMOD_B2301、pMOD_C3001、pTRANS_220d由美国明尼苏达大学Dan Voytas实验室合作提供。瞬时表达注射所用植株为室温22 ℃条件下生长1个月左右具有6～8片叶的健康野生型本氏烟草苗。

1.1.2  酶类及主要生化试剂  限制性核酸内切酶LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ購自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;T4 DNA ligase购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase 购自宝日医生物技术（北京）有限公司;质粒提取试剂盒Plasmid DNA Mini KitⅠ和胶回收试剂盒Gel Extraction Kit购自Omega Bio-Tek公司。其他试剂为国产分析纯。

1.1.3  引物  如表1所示，根据海南番木瓜曲叶病毒DNA-A基因组IR区、AV1/AV2区和AC1/AC4区序列设计的sgRNA（小写字母）和载体序列（大写斜体字母），设计引物并加入LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ酶切位点（下划线部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司广州合成部合成。

1.2方法

1.2.1  sgRNA的设计  根据本实验室从番木瓜叶片上所分离的曲叶病毒DNA全长，将其序列导入网站Tefor（http：//crispor.tefor.net/），分析可行的sgRNA和其脱靶效益，然后将理想的sgRNA序列信息导入网站Phytozome（https：//phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html）与番木瓜基因组进行Blast分析，最后将理想的sgRNA序列信息导入网站Webtools for the Voytas Lab Plant Genome Engineering Toolkit（http：//cfans-pmorrell.oit.umn. edu/CRISPR_Multiplex/assembly.php），最终确定3个sgRNA序列信息如表1所示。

1.2.2  pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6表达载体的构建与农杆菌转化  参考王绪朋等^[10]的载体构建方法，对终载体进行构建。第1步，通过PCR克隆出目的片段，PCR反应可分为4个Reaction反应，电泳后对目的片段进行胶回收。第2步，中间载体的构建。将第1步的胶回收产物与模板pMOD_B2301质粒进行第1个Golden Gate克隆反应，完成后产物转化大肠杆菌DH5α，涂板培养，挑选正确的阳性单克隆送去测序，选择与理论序列一致的阳性单克隆进行培养，提取中间载体质粒。第3步，pCRISPR-PaLCV-3sgRNA- Cas9-mgfp6终载体的构建。将第2步所提取的中间载体质粒与模板pMOD_A0101、pMOD_C3001和pTRANS_220d进行第3个Golden Gate克隆反应，完成后产物转化大肠杆菌DH5α，涂板培养，挑选正确的阳性单克隆送去测序，选择与理论结果一致的阳性单克隆进行培养，提取终载体质粒。终载体质粒经EcoRⅠ与Hind Ⅲ酶切验证无误后转化至农杆菌AGL1，菌液经PCR检测后，挑选出正确的阳性单克隆菌液备用。

1.2.3  瞬时表达与荧光观察  参考王绪朋等^[10]的载体瞬时表达重悬液配方，将含有pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6终载体的农杆菌AGL1菌液进行培养至对数生长期后离心并重悬，重悬液重悬后控制OD₆₀₀在1.0～1.2之间，放置室温3 h左右，用1 mL去针头的注射管吸取活化好的菌液并注射生长时间为1个月左右的本氏烟草叶片背部，挑选中上部的叶片为最佳，每株重复注射叶片3片，共注射3株。将注射好的烟草苗放至培养室继续培养，保持室温22 ℃，同时为了排除野生型烟草叶片本身的荧光干扰，设置了不做任何处理注射的对照组，对照组与处理组其余条件均一致。荧光观察参考Li等^[11]的亚细胞定位方法，在注射含pCRISPR-PaLCV-3sgRNA- Cas9-mgfp6终载体的AGL1菌液48 h后，将注射后的烟草叶片接种部位全部剪下，裁剪成约2 cm²的圆形，将其制成简易切片，操作OLYMPUS FLUOVIEW激光共聚焦荧光显微镜FV1000进行观察，设置激发波长为488 nm。

2  结果与分析

2.1PCR扩增目的片段与中间载体验证

PCR Reaction 1所需引物对为O35S和OtRNAB_IR，理论大小654 bp;PCR Reaction 2所需引物对为OrepC_IR和OtRNAB_R/C，PCR Reaction 3所需引物对为OrepC_R/C和OtRNAB_C/M，理论大小均为193 bp;PCR Reaction 4所需引物對为OrepC_C/M和OtRNAE，理论大小为181 bp。共有4管PCR反应产物，实际扩增情况如图1所示，对红色箭头所示的目的条带进行胶回收。在第一个Golden Gate反应结束后，含中间载体质粒的转化产物将会转化至大肠杆菌DH5α，挑菌并培养，菌液PCR用引物对TC089R/ZY010F检测，挑选与目的条带相符的3～5个阳性单克隆送至公司测序，测序信息返回后比对，选择与理论序列相符合的菌液进行培养。

2.2表达载体酶切、PCR及测序验证

在第二个Golden Gate克隆反应结束后，含终载体质粒的反应产物会转化至大肠杆菌DH5α，挑菌并培养，菌液PCR用引物对TC430/M13F检测，挑选与目的条带相符的3～5个阳性单克隆送至公司测序，测序信息返回后选择与理论序列相符合的菌液进行培养，随后提取质粒，将构建好的终载体pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6质粒进行酶切验证，挑选在终载体上分别只有一个切点位置的限制性核酸内切酶EcoRⅠ和限制性核酸内切酶Hind Ⅲ。终载体总长度为17345 bp，当EcoRⅠ与Hind Ⅲ同时酶切时，可以同时切出两条目的条带，大小为5088 bp和12257 bp，如图2和图3所示。

2.3瞬时表达荧光结果

烟草叶片注射48 h后，在488 nm蓝光的激发下，观察到由绿色荧光蛋白产生的509 nm的绿色荧光，如图4所示。处理组叶肉细胞发出荧光的部位为叶肉细胞核与细胞质膜部分，而在对照组Control中并未观察到绿色荧光的发生。由于CRISPR/Cas9基因编辑载体AtCas9、sgRNA和mgfp6基因的表达由植物35S启动子所启动，瞬时表达的结果说明该载体能在植物体内进行表达，可进行下一步转化工作。

M：DNA Marker Ⅲ;1～4分别是PCR Reaction 1–4的扩增产物。

M： DNA Marker Ⅲ; 1–4： Amplification productsof PCR Reaction 1–4.

终载体Cas9酶源自于pMOD_A0101，sgRNA部分源自于中间载体pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA，mgfp6部分源自于pMOD_C3001。

The Cas9 construct from pMOD_A0101， the sgRNA construct from pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA， the mgfp6 construct from pMOD_C3001.

本氏煙草叶片GFP荧光观察（标尺为20 ?m）。

3  讨论

在CRISPR技术未应用到双生科病毒防治之前，在对抗双生科病毒方面应用最广泛的是利用病毒基因片段诱导的抗性育种，向植物细胞转入病毒外壳蛋白、复制酶、运动蛋白等克隆基因来实现抗性。Kunik等^[12]用番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因转入番茄，接种病毒后能表现出病毒抗性，但由于CP蛋白对于单组分的双生科病毒是必须的^[13]，对于双组分的双生科病毒却不是必须的^[14]。所以用利用病毒外壳蛋白介导的抗性具有很大的局限性，后续研究用转病毒Rep、突变体REn等策略来获得病毒抗性^[15-16]，但都存在一定的局限性。随着TALE与RNAi技术的发展，陈方圆^[17]成功运用TALE技术对抗番茄黄化曲叶病毒和甘蓝曲叶病毒，通过凝胶阻滞实验与South杂交印记分析发现人工TALE蛋白可以特异性结合病毒并且降低病毒DNA积累量。Zrachya等^[18]根据病毒CP蛋白构建了siRNAs，实现了对番茄黄化曲叶病毒的抗性。Chellappan等^[19]用siRNA成功对抗非洲木薯花叶病毒。与其他基因育种技术相比，CRISPR系统操作更为简单，不需要很繁琐的载体构建过程，同时利用CRISPR系统来进行剪切DNA病毒目的直接明确，剪切效率取决于sgRNA与模板的结合效率，剪切效率与基因功能无直接关系，故减少脱靶效率才是运用该技术的重中之重。在目前关于基因编辑转基因植物抗双生科病毒的抗性研究中，2019年4月瑞士苏黎世联邦理工大学植物研究所于Genome Biology上发表文章，在本研究中，研究小组证明转化基因编辑单切点载体的转基因植物和对照组植物在对抗非洲木薯花叶病毒的抗性水平上差异不显著，并预测了基因编辑多切点载体在对抗植物病毒方面的有效性，同时发现运用CRISPR/Cas9系统对抗病毒可导致一种新的保守突变病毒的出现，基因突变导致进化出了一种新的病毒，该病毒不能被原始sgRNA-Cas9复合体所识别，从而避免了被宿主植物中CRISPR/Cas9系统切割^[20]，不过该研究并未通过转化基因编辑多切点载体来获得抗性植株并进行后续抗病试验。

本研究的试验策略基于基因编辑多切点对抗病毒的可行性，运用了Golden Gate一步克隆法构建了可以同时串联3个切点序列的抗曲叶病毒基因编辑多切点表达载体pCRISPR-PaLCV-3sgRNA -Cas9-mgfp6，此方法构建载体简单，耗时短，包括前期靶点设计，基本上15 d左右便能完成载体构建工作。在前期设计靶点时，既要考虑脱靶效率，sgRNA-Cas9复合体在对病毒DNA双链发生剪切时，是否理论上也会对植物基因组发生剪切的情况，又要考虑靶点的高效性与广谱性。同时，在设计多切点时，应保证各切点中间4个bp碱基序列至少有一个不同，否则会在构建Mould B板块时出现各切点PCR产物无法连接或者连接错误的情况发生。根据剪切核酸类型的不同，可以挑选不同种类的Cas核酸酶。本研究中所构建的终载体在sgRNA后插入一段由35S启动子引导的mgfp6报告基因，由于该报告基因本身不会发光，只有在转入植物细胞后通过35S启动子所启动后，才能转录并翻译成荧光蛋白，该蛋白可以被488 nm蓝光激发，后期通过激光共聚焦显微镜可以观察到荧光部位，该报告基因的插入可以通过瞬时表达观测荧光情况来判断载体是否构建成功以及在植物细胞内的表达情况，由于转基因植物体内会表达GFP蛋白，故选用GFP作为报告基因的缺点在于转基因植物只能局限于实验研究。本研究还需继续探讨的方面包括后期转基因作物能否稳定表达Cas9蛋白、后期转基因作物的抗病性以及脱靶效率，最终确定有抗病能力的番木瓜转化株需继续进行田间抗病试验，从而达到真正的抗病效果。

参考文献

[1] 赵  辉， 贺萍萍， 郭静远， 等. 应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展[J]. 分子植物种， 2017， 15（11）： 4590-4599.

[2] Zaidi S E A， Mansoor S， Ali Z，et al. Engineering plants for geminivirus resistance with CRISPR/Cas9 system[J]. Trends in Plant Science， 2016， 21（4）： 279-281.

[3] Ji X， Zhang H， Zhang Y，et al. Establishing a CRISPR–Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants[J]. Nature Plants， 2015， 1： 15144.

[4] Baltes N， Hummel A， Konecna E，et al. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryotic immune system[J]. Nature Plants， 2015， 1： 15145.

[5] Ali Z， Abulfaraj A， Idris A，et al. CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants[J]. Genome Biology， 2015， 16： 238.

[6] Engler C， Kandzia R， Marillonnet S，et al. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability[J]. PLoS One， 2008， 3（11）： e3647.

[7] Engler C， Gruetzner R， Kandzia R，et al. Golden gate shuffling： A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes[J]. PLoS One， 2009， 4（5）： e5553.

[8] Morbitzer R， Elsaesser J， Hausner J，et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning[J]. Nucleic Acids Research， 2011， 39（13）： 5790-5799.

[9] Bickle T A， D H Krüger. Biology of DNA restriction[J]. Microbiological Reviews， 1993， 57（2）： 434-450.

[10] 王緒朋， 赵  辉， 贾瑞宗， 等. 用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体[J]. 热带作物学报， 2018， 39（5）： 955-962.

[11] Li B， Yang Y， Luo Z，et al. Expression of secretory protein genes in candidatus liber ibacter asiaticus[J]. American Journal of Plant Sciences， 2018， 9： 2408-2419.

[12] Kunik T， Salomon R， Zamir D，et al. Transgenic tomato plants expressing the tomato yellow leaf curl virus capsid protein are resistant to the virus[J]. Biotechnology， 1994， 12（5）： 500-504.

[13] Briddon R W， Watts J， Markham P G，et al. The coat protein of beet curly top virus is essential for infectivity[J]. Virology， 1989， 172（2）： 628-633.

[14] Ingham D J， Pascal E， Lazarowitz S G. Both bipartite geminivirus movement proteins define viral host range， but only BL1 determines viral pathogenicity[J]. Virology， 1995， 207（1）： 191-204.

[15] Noris E， Accotto G P， Tavazza R，et al. Resistance to tomato yellow leaf curl geminivirus inNicotiana benthamianaplants transformed with a truncated viral C1 gene[J]. Virology， 1996， 224（1）： 130-138.

[16] Selth L A. A NAC domain protein interacts with tomato leaf curl virus replication accessory protein and enhances viral replication[J]. The Plant Cell， 2005， 17（1）： 311-325.

[17] 陈方圆. 基于人工TALE技术的抗双生病毒研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2015.

[18] Zrachya A， Kumar P P， Ramakrishnan U，et al. Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus[J]. Transgenic Research， 2007， 16（3）： 385-398.

[19] Chellappan P， Vanitharani R， Fauquet C M. Short interfering RNA accumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected hosts， and gene silencing targets specific viral sequences[J]. Journal of Virology， 2004， 78（14）： 7465-7477.

[20] Mehta D， Stürchler A， Anjanappa R B，et al. Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses[J]. Genome Biology， 2019， 20（1）： 80.