植物顶端有限生长相关基因与基因编辑育种研究进展

郭品品 任钢 李重 曾少华 德塔娜 王瑛

摘  要  随着劳动力成本的增加，农作物的采收将逐步从人工采收过渡到机械采收，因此培育紧凑、矮化、果实成熟集中、耐密植、适宜机械化操作的新品种已成为作物遗传改良的主要目标。本文重点综述了不同物种FT及其同源基因对植物成花的调控功能，植株顶端的无限生长和有限生长的控制基因及其功能研究进展，以及通过基因编辑促进顶端成花进而导致植株顶端由无限营养生长转变为有限生殖生长，进一步介绍了通过多基因同时编辑的方法推动植物株型改变并培育新品种的成功案例。植株顶端成花和有限生长的特性可以促进果实的统一成熟，为适宜机械化采收的株型育种提供理论支持和实践指导。

关键词  株型;开花;有限生长;基因编辑中图分类号  Q943.2      文献标识码  A

Progress of Determinate Growth Genes and Gene Editing Breeding

GUO Pinpin¹， REN Gang²， LI Zhong³， ZENG Shaohua¹， DE Tana²， WANG Ying^1*

1. South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences / Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement， Chinese Academy of Sciences / Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， Guangzhou， Guangdong 510650， China; 2. Haixi Institute of Agricultural Science， Delingha， Qinghai 817000， China; 3. Bryel Goji Stock Co.， Ltd.， Yinchuan， Ningxia 750200， China

Abstract  With the increase of labor cost， there will be a gradually transition for the harvesting of fruits and vegetables from manual harvesting to mechanical harvesting. Therefore， developing new compact and mechanical harvest plant varieties with synchronized ripening period has become the main target of genetic improvement. This review summarized the flower development related genes， especiallyFTand homologous genes controlling the indeterminate and determinate growth at the top of the main stem of plants， and the successful breeding model of promoting the apical flower formation using the CRISPR/CAS9 gene editing system， which leads to the transformation of the top of the main stem into flower development and stops continuing to grow. In addition， gene editing of multiple genes relating to plant apical structure and fruit characters were successfully used for new cultivar development. Apical flower and determinate growth can promote the synchronized fruit ripening and faciliate mechanical harvest， which would provide a theoretical and practical guidance for the future breeding alternating plant structure or plant type.

Keywords  plant type; flowering time; determinate growth; gene editing

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.014

植物株型就是植株的形狀，即植株个体在空间的几何分布状态。植株的主干顶端的特征直接决定植株的高度和产量，以及植株整体的果实成熟一致性。植株的株型研究多年来一直是作物生理、栽培和育种等学科研究的热点。不同物种的植株株型及其生长发育特征直接跟产量、品质、栽培管理成本等密切相关。目前中国劳动力供求格局发生了质的变化，农村的农业劳动力数量短缺和劳动力质量下降现象非常严重，我国的农业生产正在经历着从劳动密集型到工业化和机械化农业的转变。因此，随着劳动力成本的增加，培育株型紧凑、矮化、成熟集中、耐密植、适宜机械化的新品种已成为遗传改良的主攻目标，本文综述了花发育的基因功能，植株顶端的无限生长和有限生长的控制基因及其功能研究进展，以及通过基因编辑促进顶端成花进而导致植株顶端转变为有限生长的成功育种模式，进一步探讨了通过基因编辑的方法推动植物株型改变并培育新品种的新进展。

1  株型育种理论

农作物的株型一般分为叶型、茎型、穗型和根型。其中叶型和茎型明显地影响植株的冠层大小、分布、田间群体结构状况和小气候，研究它对提高光能利用率和作物产量、降低栽培用工量，发展工业化农业，促进农业机械化、自动化和信息化有着重要意义。植株主茎顶端的发育对于茎型的改变、植株高度、植株密度、生长发育周期及产量具有重要的影响。

1968年，澳大利亚科学家Donald提出作物的理想株型，是指每单位生产的干物质要对资源的需求降到最低，并指出小麦的理想株型主要包括短而强壮的茎秆，叶片直立状、穗大、花多等指标，以及高密度栽培下的产量问题^[1]。之后关于水稻、玉米、大麦、黄豆、番茄、月季等植物的株型育种研究陆续开展起来^[2]。

2  植物成花诱导基因的研究进展

成花素“florigen”（flower-former）于1936年提出，被定义为一种具有刺激成花功能的物质^[3]，FT（FLOWERING LOCUS T）是拟南芥中编码成花素的候选基因，和分生组织基因LFY（LEAFY）一起，在接收到光受体传给转录因子CO（CONSTANS）的信号后，促进植物开花，但FT拮抗TFL1（TERMINAL FLOWER1）^[4]。

FT在促进拟南芥开花时，与一个bZIP转录因子FD（FLOWERING LOCUS D）协同作用，FD在成花诱导之前就已经在茎尖处表达^[5]，而FT mRNA在叶片中表达，FD蛋白整合时间和空间上的信息后，和FT蛋白形成复合体反过来激活花形成基因，如AP1（APETALA1）^[6]。嫁接实验表明，FT在葉片中转录后，不需要其他媒介物便可以从韧皮部移动至茎尖端，进行长距离运输^[7]，FT蛋白便可作为这种可移动的信号物质^[8]。

FT作为开花整合因子，需整合光周期途径、自主途径、赤霉素途径、年龄途径、温敏途径、春化途径等至少6条途径，调控植物开花^[9]。从晚花拟南芥中分离出来的FLF（FLOWERING LOCUS F），编码1个MADS-box蛋白，经过图位克隆和分析，认为和FLC（FLOWERING LOCUS C）是同1个基因^[10]。春化作用下促进拟南芥晚花生态型和晚花突变体开花，是通过降低FLC表达水平实现的^[11]，由此可以看出，在开花调控途径中，FT位于FLC下游。FT不仅能够促进植物开花，还可以促进种子萌发，而且具有母体遗传效应^[12]。不同于开花，FT调控种子休眠时，是位于FLC的上游，抑制FLC表达;ChIP实验表明FT结合在FLC的下游区域，即COOLAIR转录起始位点附近^[13]。也有研究表明，FT抑制FLC表达是通过FLC上游启动子区域进行的^[14]。

水稻中FT的同源基因是Hd3a（Heading date 3a），由叶片向顶端分生组织中运输，并诱导水稻开花，Hd3a蛋白很有可能就是水稻成花素^[15]。Hd3a蛋白可以和GF14c（G-box factor 14-3-3c）蛋白互作，GF14c是水稻开花的负调节蛋白^[16]。在水稻茎尖顶端细胞中，Hd3a蛋白和GF14c蛋白形成复合体迁移至细胞核内，结合水稻中FD的同源转录因子OsFD1，组成三元成花素激活复合体FAC（FLORIGEN ACTIVATION COMPLEX），激活水稻中AP1的同源基因OsMADS15转录，进而促进水稻开花^[17]。

番茄中FT的同源基因是SFT（SINGLE FLOWER TRUSS），sft突变体属于晚开花表型：初级分生组织形成的第1个花序是在植株长出15～20片叶子后，相比于野生型的8～12片叶子;此外，sft突变体相比于野生型番茄，在合轴分生组织处变成了营养型花序：叶片增多，花朵减少，且每个花朵中有1片花萼增大^[18]。

甜菜中FT的同源基因BvFT1（Betta vulgaris FLOWERING LOCUS T）抑制开花，同时它的下调对于春花作用的响应也至关重要，而BvFT2具有保守的FT功能，促进甜菜开花^[19]。

3  植株顶端分生组织的有限生长和无限生长控制基因研究进展

植株顶端的分生组织有营养生长和生殖生长2种状态。植株主茎顶端营养生长可以使植株持续长高，为无限生长类型;其转变为生殖生长与顶端的花分化密切相关，进而形成有限生长的植株。

野生型拟南芥花朵在顶端分生组织处依次螺旋生长，称之为无限生长（indeterminate growth），突变体terminal flower在长出一些正常带花梗的花之后，顶端分生组织中发育出部分缺少花梗的花朵而使花序停止生长，表现为有限生长（determinate growth）^[20]。同样，金鱼草在成花诱导几天后，CENTRORADIALIS（CEN）在花序顶端表达，使得花序以一朵花的形式停止生长，也表现为有限生长^[21]。HvCEN（Hordeum vulgare CENTROR ADIALIS）是大麦中CEN的同源基因，它是对遗传变异的选择和富集，而不是驯化获得的突变^[22]。

TERMINAL FLOWER1（TFL1）是金鱼草中CEN的同源基因，不同的是TFL1也在营养生长阶段表达，并推迟了向花序发育的转变，进而推迟了花序分生组织的形成^[23]。水稻中TFL1/CEN-like基因在调控居间分生组织活动中也发挥着重要作用^[24]。此外，TFL1蛋白像FT蛋白一樣，也是作为一种移动的信号物质在分生组织间传递，但是TFL1蛋白并不进入到分生组织周围的细胞内，进而不会对原基分化产生影响^[25]。

月季和草莓中TFL1的同源基因，在持续开花型CF（continuous flowering）和仅开1次花型OF（once flowering）中，不同的反转座子插入，改变它们的开花季节^[26]。葡萄中TFL1的同源基因，使葡萄呈现簇状变异^[27]。

SELF-PRUNING（SP）是番茄中CEN和TFL1的同源基因，调控合轴分生组织从营养生长阶段到生殖生长阶段的转变;含有隐性纯合SP基因植株中，合轴单元间的叶片数连续减少，并以最终形成的2个连续花序，使得植株顶端停止生长，即有限生长。SP基因型的番茄中主干封顶的习性在侧枝中一样出现，使得每个枝条生长被压缩，株型紧凑，坐果期一致;随着隐性SP渗入到番茄栽培种中，这种封顶生长习CENTRORADIALIS性促进了番茄的机械化采收^[28]。

CEN、TFL1和SP等基因，在不同物种中具有保守地改变植物株型的重要作用，归类为CETS基因，编码一类和14-3-3家族相似功能的蛋白^[29]，属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因家族（phospha tidylethanolamine-binding protein，PEBP），具有保守的PBP（PF01161）结构域。拟南芥中PEBP家族基因主要包括FT、TFL1、TSF（TWIN SISTER of FT）、MFT（MOTHER of FT and TFL1）、BFT（BROTHER of FT and TFL1）、ATC（Ara bidopsis thaliana CENTRORADIALIS homologue）6个成员。

4  植物顶端生长性状的基因编辑育种进展

封顶（determinacy）是大豆驯化的重要农艺性状之一，有限生长型（determinate genotype）dt1/dt1和无限生长型（indeterminate genotype）Dt1/Dt1杂交后代中出现单基因分离模式^[30]。从大豆基因组中分离出2个同源基因GmTFL1a（Glycine max TFL1a）和GmTFL1b（Glycine max TFL1b），GmTFL1b是Dt1的候选基因，通过基因沉默改变1个氨基酸可以获得封顶的有限生长的大豆^[31]。

番茄中纯合基因型SP背景下，sft突变后，植株开花推迟，长出的花朵和果实减少，但杂合状态的sft番茄植株产量却增加60%，说明sft具有杂种优势效应^[32]。杂合状态的sft在延迟番茄主干和侧枝开花方面具有半显性作用，通过对顶端分生组织的转录组测序，说明成花素途径中SFT转录本水平对于产量的增加具有剂量效应^[33]。诱导成花素途径中基因突变，便可改变植株产量;SUPPRESSOR of SP（SSP）可以使SP突变体恢复无限生长，ssp-1906突变体和野生型一样，每一个合轴分生组织间3片叶子，但是ssp-2129和ssp-610突变体每个合轴分生组织是2片叶子，相比于野生型，花序密度更高^[34]。此外，SP5G（SELF-PRUNING 5G）促进长日照条件下番茄果实的早熟和高产^[35]。2018年，许操和高彩霞团队合作，以野生醋栗番茄为基础材料，利用含有多个基因的CRISPR/CAS9载体系统，基因编辑同时精准靶向开花光周期敏感性、顶端封顶和果实同步成熟控制基因SP和SP5G、果实大小控制基因SlCLV3和SlWUS和维生素C合成酶基因SlGGP1，将产量和品质性状精准地导入野生番茄，加速了野生植物的人工驯化，成功将醋栗番茄无限生长型的株型变成了“双有限”生长型的紧凑株型，提高了坐果率、果实成熟的同步性和收获指数^[36]。该研究首次通过多基因多靶点的同时基因编辑实现野生植物的快速驯化，为新品种的精准设计和创造全新作物提供了新的策略，开启了多基因同时编辑的育种时代。

多年生木本植物猕猴桃（Actinidia）染色体基数为29，倍性变化大，且植株本身具有攀爬习性。新西兰的研究团队通过对猕猴桃中CEN（CENTRORADIALIS）-like基因AcCEN4和AcCEN进行基因编辑，产生的双等位基因变异，呈现早花表型、顶端有限生长和植株紧凑生长习性，最重要的是，这种编辑成功做到了把多年生木本植物的生活周期一年内便可完成，极速加快了育种进程^[37]。

不同于拟南芥的单轴分枝、番茄的合轴分枝，棉花叶枝单轴分枝而结果枝合轴分枝，并且结果枝对于棉花株型和产量有重要影响。研究发现控制海岛棉腋生花基因GbAF（Gossypium barbadense axillary flowering）和陆地棉簇生花基因cl1（Gossypium hirsutum clustered boll）是Cl1位点的等位基因，更是番茄中SP同源基因，通过基因编辑突变四倍体棉花A或D亚基因组中任何一个GoSP基因，产生簇生花，同时基因编辑突变这2个GoSPs，结果枝表现为有限生长，这样的紧凑株型使得棉花可以高密度种植，不仅能够增加产量，而且利于棉花的机械化采收^[38]。此外，GhSP（Gossypium hirsutum SELF-PRUNING）维持陆地棉中各顶端的生长状态，基因编辑能够突变GhSP，使单轴分枝和合轴分枝的无限生长变为有限生长，推动了陆地棉的基因编辑育种的发展^[39]。

此外，通过基因编辑技术，靶向编辑茄科的孤生作物菇娘果中的SP和SP5G同源基因，使得无限生长的蔓生植株呈现封顶表型，该研究发现基因编辑技术对于这种遗传背景尚不清晰的植物的育种改良，同样能够达到预期的效果，可以推动小作物的快速育种^[40]。

5  总结与展望

随着基因组编辑技术的发展，作物育种在发生革命性的变化^[41]。通過优化CRISPR/Cas9系统，使得基因编辑在模式和非模式物种中都得到了广泛而深入的应用，Feng等^[42]将dmc1启动子驱动Csa9蛋白表达实现了对玉米基因组的高效编辑;Liu等通过优化sgRNA表达框实现了对浮萍的有效编辑^[43];Liu等通过在表达框中添加了PF框（PAP1促进花青素的积累，FT促进花期提前）实现了可视化选择阳性植株，获得的紫色叶片且花期提前的植株转基因事件发生的概率为100%，极大地提高稳定遗传转换后期筛选工作效率^[44];Wang等开发了PTG/Cas9基因编辑系统，PTG/Cas9的编辑效率是CRISPR/Cas9的32倍以上，并在猕猴桃中实现了定向编辑^[45]。运用多元CRISPR/Cas9系统对野生番茄中位于基因编码区、顺式调控区、开放阅读框上游序列等实现靶向基因编辑，成功编辑株型、花朵、产量相关基因，从而加速驯化和育种改良进程^[36]。此外，基因编辑技术已经能够实现番茄中提高减数分裂时交换发生的频率以及调控减数分裂发生位置，来简化育种程序、缩短育种周期^[46]。基因组编辑技术的不断发展，大大的提高了该技术的适用范围，同时针对某个物种的定向优化提高了CRISPR/Cas9系统的特异性，使得该系统能够针对特定物种的高编辑效率，低脱靶失误成为可能。

因此，结合新基因功能发现和定向优化CRISPR基因编辑技术，可以在推动快速挖掘和鉴定新基因功能的同时，通过设计物种特异的基因组编辑系统进行人工定向育种，可以实现真正意义的分子设计育种。这一技术将成为基因组和遗传背景研究尚未深入的小作物或经济作物（如热带和亚热带的药用植物等资源植物）高效精准育种的新技术。同时我们必须看到，目前CRISPR基因编辑技术中的编辑效率和脱靶率是未来研究的关注重点，不同作物需要优化的CRISPR载体，才能提高编辑效率，降低脱靶率，达到物种较高编辑效率，真正缩短育种时间和提高育种效率。除此之外，仍需注意基因编辑产生的变异与生物体内已有隐秘变异（Cryptic variation）之间的作用，对基因编辑育种的影响^[47]。

2016年，美国宾夕法尼亚州大学伯克分校的杨亦农专家团队通过编辑白色双孢菇中一类编码导致褐变的多酚氧化酶（PPO），而使它具有了抗褐变能力，且美国农业部表示并不认为有必要对此基因编辑蘑菇进行监管，意味着这种基因编辑蘑菇可以直接用于种植和销售^[48]。美国农业部作为评估转基因农业产品部门之一，认为基因编辑作物不应像“传统”转基因生物那样接受同样严格的监管，而传统的转基因技术必须接受动植物检疫局（APHIS）监管;接着，全球第四大农化产品公司杜邦公司宣布了其使用基因编辑技术得到的高质量糯玉米品种（监管豁免）上市计划;加拿大、阿根廷、巴西、智利、以色列等国家已发布类似美国的基因编辑作物管理政策。2018年，日本政府委员会规定基因编辑作物不属于转基因法规监管范畴;澳大利亚亦不将基因编辑视为“基因改造”;英国政府也已批准以试验方式种植经过基因编辑旨在强化omega-3含量的亚麻籽。我国对于基因编辑新品种的管理制度尚在完善过程中，未来基因编辑技术的发展和应用前景广阔。

機遇与挑战并存，基因组编辑技术的不断优化将极大地变革传统育种方式，同时基因组编辑技术也将弥补分子设计育种存在的先天不足，实现优势互补，这对未来提高经济作物产量和质量大有裨益。

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