基于体外抑菌作用的金莲花系列制剂谱-效关系研究

伍利华，钟林江，杨俊莉，张小雪，马焓彬，刘 涛

(成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106)

0 引 言

金莲花系列制剂由金莲花一味中药制得，包括金莲花口服液、金莲花片、金莲花胶囊和金莲花颗粒，是《中国药典》2015版一部收录中药单味制剂，临床用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎等。研究发现，各剂型生产工艺参数不同，剂型有异，而功能主治现象却完全相同[1]，由于制备工艺不同，药效物质基础可能存在差异，其合理性有待评价。

中药谱效关系是指建立在中药指纹图谱的研究基础上，最大限度地获取有用的化学信息，将标示物质与药效结果联合分析，为确定中药质量药效物质基础、制定反应产品内在质量的控制标准而进行的研究[2]。中药谱效关系通过化学成分研究结合药理研究，能够阐明有效化学成分的整体疗效及其相互间关系，构建的药效指纹图谱能更有针对性的控制中药质量。

金莲花化学成分复杂，多数为黄酮类化何物，主要包括荭草苷、牡荆素及其衍生物等。目前对金莲花制剂的研究大多是对一种制剂进行含量测定、指纹图谱和药理研究，未检索到关于金莲花4种制剂对比研究和联合药效的文献[3-6]。中药发挥药效作用物质基础复杂，可能不是单一成分起效，而目前指纹图谱也仅体现某一波长项下可被检测的物质，仅用指纹图谱无法表征其临床药效。本文采用高效液相色谱法建立金莲花4种制剂的指纹图谱，并以药用生药量为指标，测定金莲花4种制剂对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的最小抑菌生药量。通过相关性分析，探讨指纹图谱特征峰与抑菌活性的相关性，并以此对剂型进行再评价。

1 仪器与试药

DZTW电子调温电热套（天津市静海县工兴电器厂）；FA2004 分析电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；旋转蒸发仪（成都康宇科技有限公司）；麦氏比浊管（温州市康泰生物科技有限公司）；DZF-6050A真空干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHZ-DⅢ型循环水真空泵（郑州杜甫仪器厂）；JJCJ-2FD洁净工作台（苏州金净净化有限公司）；XFS-280手提式压力蒸汽灭菌锅（浙江新木医疗器械有限公司）；DH-系列电热培养箱（西安禾普科技有限公司）；P230Ⅱ高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）。

金莲花（购自成都市荷花池中药材市场，批号20180219），经成都大学药学与生物工程学院刘涛研究员级高级工程师鉴定为毛茛科金莲花属植物金莲花Trollius chinensisBunge的干燥花。荭草苷对照品（批号 wkq16031602，HPLC≥98.0%）、牡荆素对照品（批号 wkq16031606，HPLC≥98.0%），对照品均购自四川维克奇生物科技有限公司。磷酸（成都市科龙化工试剂厂，批号 20170951，含量≥85.0%）；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂为分析纯，水为怡宝纯净水。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，均由成都大学生物技术实验室提供。

2 方法与结果

2.1 金莲花系列制剂的制备

目前市场上出售的金莲花制剂有金莲花口服液、金莲花片剂、金莲花颗粒及金莲花胶囊等，各个厂家生产环境、原药材来源、设备设施各异，制备工艺参数有别，工艺规程有异，上市产品质量差异较大，且可能存在药用辅料对抑菌活性测定的影响，为减少实验误差，故本实验未购买已上市金莲花系列制剂作为样品而是按照《中国药典》2015年版一部相应品种项下的工艺参数制备。

按照《中国药典》2015年版一部金莲花制剂项下制备方法，分别制得生药量为0.454 5 g/mL、3.017 2 g/g、2.882 8 g/g、2.916 9 g/g 的金莲花口服液、金莲花片、金莲花颗粒及金莲花胶囊。

2.2 金莲花4种制剂的最小抑菌生药量测定

2.2.1 金莲花 4 种制剂供试品储备液制备

以口服液为标准，根据相同生药量，分别取金莲花4种制剂适量，精密称定金莲花胶囊、片及颗粒 4.045 1 g、4.288 7 g、4.227 5 g 于 25 mL 容量瓶中，加纯净水定容摇匀制得 0.161 8 g/mL、0.171 5 g/mL、0.169 1 g/mL 的供试品储备液。

2.2.2 营养肉汤培养基和营养琼脂培养基平板的配制

称取营养肉汤粉末约 3 g，加入 100 mL蒸馏水，搅拌溶解即得营养肉汤培养基。称取牛肉浸膏0.6 g、蛋白胨2 g、琼脂 3～4 g、氯化钠1 g，加水200 mL，加热搅拌溶解即得。取灭菌培养皿，倒入15 mL培养基，冷却，即得牛肉膏蛋白胨平板，备用。

2.2.3 菌液配制

取两支灭菌试管加入适量无菌水，冷却至室温，接种环灼烧后分别挑取适量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，与麦氏比浊管比对，制成 1.5×108CFU/mL的菌液，备用。

2.2.4 最小抑菌生药量测定

取编号为1～11的试管，每支试管按供试品储备液：培养基体积比1∶1加入营养肉汤培养基，1～5号为大肠杆菌组（5号不加药液，为阴性对照），6号为空白（不加菌液），7～11为金黄色葡萄球菌组（11号不加药液，为阴性对照）；分别按试管二倍稀释法制得 1～5号大肠杆菌试管组和7～11号金黄色葡萄球菌试管组；加入50 μL菌液、棉塞塞住试管口于37 ℃下培养24 h后，取2.2.2所得平板划线接种，37 ℃培养24 h，测定结果见表1。结果表明金莲花口服液抑菌生药量最小，抑菌效果最优。

表1 金莲花系列制剂抑菌生药量

2.3 金莲花系列制剂指纹图谱的建立

2.3.1 供试品溶液的制备

精密量取2.2.1项下供试品储备液1.00 mL于50 mL容量瓶中，加纯净水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称定牡荆素对照品5.61 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得224.4 μg/mL的牡荆素贮备液。精密称定荭草苷对照品10.00 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得200.0 μg/mL的荭草苷贮备液。精密量取牡荆素贮备液2.00 mL、荭草苷贮备液1.00 mL，混合至5 mL容量瓶中，加甲醇定容摇匀得 97.92 μg/mL 牡荆素、40 μg/mL 荭草苷混合对照品溶液，作为混合对照品指认色谱峰。

2.3.3 色谱条件

Supersil C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.2% 磷酸（B）；体积流量1.0 mL/min，进样体积 10 μL；检测波长 220 nm；柱温 30 ℃，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱条件

2.3.4 稳定性试验

取金莲花口服液按2.3.1项方法制备供试品溶液，将同一供试品溶液分别于 0，2，4，6，8，10，12 h进样分析，计算其各共有峰相对峰面积和相对保留时间，其RSD值分别小于3.00%和2.00%，结果表明供试品在12 h内稳定，详见表3。

2.3.5 精密度试验

取金莲花口服液按2.3.1项下方法制备供试品溶液，同一供试品溶液重复进样6次，计算其各共有峰相对峰面积和相对保留时间，其RSD值分别小于2.90%和1.20%，结果表明仪器精密度良好，详见表4。

2.3.6 重复性试验

取金莲花口服液按2.3.1项方法平行制备供试品溶液6份，进样分析，计算其各共有峰相对峰面积及相对保留时间，其RSD值分别小于2.00%和1.00%。结果表明供试品溶液重复性良好，详见表5。

表4 精密度实验结果

2.3.7 指纹图谱的建立

取金莲花4种制剂，按2.3.1项下方法制备供试品溶液，按2.3.3项下色谱方法进行测定，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（药典委员会2004A版）”对数据进行分析，确定了13个共有峰。金莲花4种制剂指纹图谱如图1～图4所示。经对照品HPLC图谱指认，确认10号和12号峰分别为荭草苷和牡荆素。混合对照品图谱见图5。

表5 重复性实验结果

图1 金莲花口服液HPLC指纹图谱

图2 金莲花片HPLC指纹图谱

3 金莲花4种制剂HPLC指纹图谱相似度分析

图3 金莲花胶囊HPLC指纹图谱

图4 金莲花颗粒HPLC指纹图谱

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（药典委员会2004A版）”对金莲花4种制剂指纹图谱进行相似度分析，以金莲花口服液为对照指纹图谱，色谱峰自动匹配；结果表明金莲花颗粒、金莲花胶囊、金莲花片的相似度分别为0.996、0.980、0.978。谱图见图6。S2为金莲花口服液对照谱图，S1、S3、S4分别为金莲花颗粒、金莲花片及金莲花胶囊。

4 金莲花系列制剂谱-效相关性分析

文献研究表明[7]，金莲花中抑菌活性成分为荭草苷，在金莲花系列制剂指纹图谱中，10号峰经对照品指认为荭草苷，且分离度良好，故选择金莲花系列制剂指纹图谱中10号峰为参照峰，其相对峰面积比值为1，计算金莲花系4种制剂指纹图谱中共有色谱峰的相对峰面积。采用“Statistical Product and Service Solutions”软件进行相关性分析[8-9]，得到各个共有峰与抑菌作用的相关性。表6为金莲花制剂指纹图谱共有峰面积相对峰面积与抑菌生药量的相关性分析结果，由2.2.4可知，所需的抑菌生药量越低，其抑菌活性越强。由表可知峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 与抑菌生药量成负相关，即与抑菌活性成正相关，峰2、13与抑菌活性成负相关。其中，峰1、7、8、9、11对金黄色葡萄球菌抑菌作用相关性与其他峰相比较有显著性差异（P＜0.05），峰 3（P＜0.05）、峰 12（P＜0.01）对大肠杆菌的抑菌作用相关性也有显著差异。12号峰经对照品指认为牡荆素，具有一定抗炎作用[10]。

图5 混合对照图谱

图6 金莲花四种制剂HPLC指纹图谱相似度分析

5 结束语

药物是临床用于预防治疗疾病的物质，理想的质量标准能够控制药物的安全性和有效性，但目前中药质量的控制方法、评价指标以及标准与中药的有效性关联不强，缺少能够反映中药有效性的质量控制体系。中药谱效关系的建立可以确定中药药效物质基础、为制定反映产品内在质量的控制标准提供依据。

目前谱效分析研究多应用于中药材及中药注射液化学指纹图谱与体外活性的相关性，未发现采用谱-效关系对中药系列制剂进行再评价的研究[11-13]，本文通过对金莲花系列制剂的谱-效研究，发现了在本色谱条件下，峰1、7、8、9、11对金黄色葡萄球菌有显著的抑菌作用，峰3与峰12对大肠杆菌的抑菌也有显著作用，表明在生产工艺及质量控制过程中，应着重地对这7个峰进行重点关注。由于中药的功能主治多样，构建的谱效模型能否阐明药物所有活性的物质基础有待进一步研究。

表6 金莲花系列制剂指纹图谱共有峰相对峰面积及与抑菌生药量相关性1)-3)

本文通过对金莲花系列制剂化学指纹图谱建立与体外抑菌活性测定，综合谱效相关性，结果表明金莲花口服液剂型优于金莲花颗粒、金莲花片和金莲花胶囊，即不同的生产制备工艺对各制剂化学成分有一定影响，从而出现体外抑菌活性出现差异。药物的活性成分需进入血液后才能发挥作用，本研究采用体外生物活性测定，药效指标不能完全反映对人体药理效应，后续研究将建立动物模型测定金莲花制剂体内生物活性，我们目前仅指认两个色谱峰，后续将采用液质联用等技术对其他色谱峰进行分析指认；金莲花抗菌谱较广，后续研究将对金葡菌和大肠杆菌之外的细菌（如肺炎链球菌等）展开研究，较为全面地对4种剂型的适应症进行再评价研究。