黑果枸杞抗氧化能力评价及比较研究

尹民强，吴金龙，王天琦，余琼卫，马兆成*

（1.华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉 430070；2.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州 450004；3.武汉大学化学与分子科学学院，生物医学分析化学教育部重点实验室，湖北武汉 430072）

氧化损伤是导致衰老、炎症、肿瘤、老年痴呆、糖尿病、免疫性疾病及心脑血管疾病的重要原因。目前，多种人工合成抗氧化剂和天然抗氧化剂已被用于抗氧化研究中[1-4]。其中，黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）、宁夏红枸杞（Lycium barbarumL.）、蓝莓（Vaccinium Spp）、黑醋栗（Ribes nigrumL.）、黑葡萄（Vitis viniferaL.）及桑葚（Morus albaL.）由于自身含有丰富的多糖、维生素、花青素、类黄酮等多种抗氧化活性物质[5-8]，有很高的保健及药用价值多用作天然抗氧化剂[9-13]。目前，已有大量对上述物质单一品种的抗氧化活性评价研究，但多个品种的抗氧化活性系统评价及比较的研究较为鲜见。鉴于此，本研究以青海黑果枸杞为试验对象，选择宁夏黑果枸杞、宁夏红枸杞、黑醋栗干、吐鲁番黑加仑葡萄干、蓝莓干及桑葚干为对照，对它们的抗氧化能力进行了系统评价及比较分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

本试验选择了市场上7 种不同的干果材料，分别是黑果枸杞1（青海）、黑果枸杞2（宁夏）、宁夏红枸杞（银川）、桑葚干（山东）、黑醋栗干果（黑龙江）、吐鲁番黑加仑葡萄干（新疆）、野生蓝莓果（黑龙江）若干。

1.1.2 试剂及仪器

BCA 蛋白质浓度测定试剂盒，PBS 溶液，生理盐水，ASPEN 公司；羟自由基测试试剂盒，总抗氧化能力（TAOC）测试盒（ABTS 法），总抗氧化能力（T-AOC）测试盒（FRAP 法），抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；DR-200Bs 酶标仪，Diatek 公司；TGL-16c 台式离心机，上海安亭科学仪器厂；TGL-16冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器；IMS-20 制冰机，常熟市雪科电器有限公司；HH-W-600 水浴锅，金坛市江南仪器厂；FD-1A-50 冷冻干燥机，北京博医康仪器有限公司；分光光度计、比色皿等。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

每个样品准确称取2 g，分别加入8 mL 的PBS，冰水浴条件下机械匀浆，以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4 ℃、12 000 rpm/min 离心5 min，取上清液测定，用完置于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 样品中蛋白质浓度测定

按照BCA 蛋白质浓度测定试剂盒方法，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒对样品中蛋白浓度进行测定。配制工作液：根据蛋白标准品和样品数量，按5 mL BCA 试剂A 加0.1 mL BCA 试剂B（50：1）配制适量BCA 工作液，充分混匀，并按照表1 将标准品稀释至0.025～2 mg/mL。将25 μL 标准品和每种样本的6 个重复分别加入96 孔板微孔中，在各孔中再加入200 μL BCA 工作液，充分混匀，37 ℃孵育30 min。冷却至室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白质浓度。

表1 蛋白质标准样品稀释方法Table 1 Dilution method of protein standard sample

1.2.3 清除抑制羟自由基能力测定

使用羟自由基测试试剂盒对各个样品的抑制羟自由基能力进行测定。取4 个5 mL 离心管，记为标准空白管、标准管、对照管和测定管，配置4 种溶液。配置方法如下，标准空白管：0.4 mL 蒸馏水；标准管：0.2 mL 蒸馏水+0.2 mL、0.03% H2O2，对照管：0.2 mL 蒸馏水+0.2 mL 底物应用液；测定管：0.2 mL 样本溶液+0.2 mL 底物应用液。然后在所有管中加入0.4 mL 试剂3 应用液，混匀，37 ℃准确计时1 min（要求加完试剂3 就开始计时，每次一管），立即加入2 mL 显色剂终止反应。混匀，室温放置20 min 后，在1 cm 光径、550 nm 条件下，使用蒸馏水调零，然后测定各管吸光度（OD值）。清除自由基能力计算公式见式（1）。

式中，标准品浓度8.824 mmol/L，待测样本蛋白浓度mgprot/mL，取样量0.1 mL

1.2.4 总抗氧化能力测定

分别使用总抗氧化能力（T-AOC）测试盒（ABTS 法）和总抗氧化能力（T-AOC）测试盒（FRAP 法）对不同样品的总抗氧能力进行测定。

ABTS 法：首先每种样品重新准确称取1 g，按质量：体积=1：10(g：mL) 的比例，分别加入10 mL 的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4 ℃、12 000 rpm/min 离心5 min，取上清液测定。然后分别在空白孔、标准孔和测试孔中加入10 μL蒸馏水、10 μL 不同浓度的MTrolox 溶液（标准品Trolox溶液用蒸馏水稀释成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L 浓度制作标准曲线）和10 μL 待测样品溶液。接着加入20 μL过氧化物酶与检测缓冲液混合液（过氧化物酶与检测缓冲液按1：9 的比例配制，现用现配）和170 μL ABTS 工作液（按检测缓冲液：ABTS 溶液：过氧化物应用液=76：5：4 的比例配制）。最后室温反应6 min，在波长405 nm 下使用酶标仪读取各孔OD值。并以标准品OD值为横坐标，各OD值对应的标准品浓度为纵坐标制作标准曲线。

在采用Trolox 作为标准品进行总抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力可以用Trolox-Equivalent Anyioxidant Capacity（TEAC）来表示。提取后的溶液与某个摩尔浓度Trolox 的抑制率相同，计算时用该浓度下Trolox 的摩尔浓度另外除以提取物的蛋白浓度，最后以mmol/g 来表示。

FRAP 法：使用1.2.1 的样品。首先配制不同浓度的标准品溶液：称取27.8 mg 本试剂盒提供的FeSO4-7H2O，溶解并定容到1 mL，此时浓度为100 mmol/L，取适量100 mmol/L 的FeSO4-7H2O 溶液用蒸馏水将其稀释到0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。接着分别在空白孔、标准孔及测定孔（每种样品6 个重复）中加入5 μL 蒸馏水、5 μL 不同浓度的标准品溶液、5 μL 样品溶液，最后都加入180 μL FRAP 工作液（试剂盒中将试剂1、2、3 以10：1：1 混匀充分，避光37 ℃孵育，现用现配），37 ℃孵育3～5 min，使用酶标仪读取各孔在波长593 nm 下的OD值。并以标准品OD值为横坐标，各OD值对应的标准品浓度为纵坐标制成标准曲线。

总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示，如干果匀浆测定的OD值与3 mmol/L FeSO4的OD值相同，干果匀浆的蛋白浓度是1 mgprot/mL，干果匀浆的总抗氧化能力为3 (mmol/L)/(1 mg/mL)，即3 (mmol/L)/gprot。

1.2.5 抑制超氧阴离子能力测定

使用抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒（比色法）对样品抑制与产生超氧阴离子自由基能力进行测定。首先在对照管、标准管和测定管（每种样品6 个重复）分别都加入1 mL 的试剂1，0.1 mL 的试剂2、试剂3 及试剂4。接下来在对照管中加入0.05 mL 蒸馏水，在标准管中加入0.05 mL、0.15 mg/mL 的VC 标准品，并在每支样品管中加入0.05 mL 的样品。用旋涡混匀器充分混匀，置于37 ℃恒温水浴40 min，最后在每支管中加入2 mL显色剂，混匀，10 min 后倒入1 cm 光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550 mm 处比色。计算公式见式（2）。

式中，标准品浓度0.15 mg/mL，待测样本蛋白浓度gpro/L。

1.2.6 黑果枸杞提取成分稳定性考察

称取黑果枸杞17 g 于小烧杯中，45 ℃下置于真空干燥箱中干燥72 h，然后置于研钵中，加入液氮磨碎成粉末，-20 ℃避光保存。

准确称取50 mg 黑枸杞粉末于1.5 mL 离心管中，以1：15 的液料比加入750 μL、2%甲酸甲醇（即体积比甲酸：甲醇=2：98），室温下避光浸提24 h。8 000 r/min 离心10 min，取上清液进入高效液相色谱（HPLC）检测。

液相色谱条件：色谱柱为Pntulips SBP-C18（4.6 mm×250 mm＜i.d.＞，5 μm）。流动相A 为甲醇，B 为含0.5%甲酸水溶液。梯度淋洗程序，0～3 min：80%～70% B；3～13 min：70%～60% B；13～25 min：60%～50% B；25～35 min：50%B；35～40 min：50%～80%B；40～60 min：50%～80%B。流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为525 nm，进样量为10 μL。

1.3 数据处理

使用Excel 2016 和Numbers（Apple）统计及处理数据，使用Graphpad Prism 7.0（GraPhpad Software）作图。然后使用SPSS 25（IBM）进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 不同干果羟自由基清除能力的对比

羟自由基氧化性极强，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂和蛋白分解的主要原因，因此羟自由基的清除能力是衡量一种物质抗氧化活性的重要指标[3，4]。表2 显示了不同品种干果中的蛋白浓度和清除自由基能力，由表可以看出，试验用各种干果均有不同的羟自由基清除能力，其中两种黑果枸杞和野生蓝莓果的羟自由基清除能力都达到了1.45 U/mgprot 以上，黑果枸杞1 的清除能力尤为突出，是所有测试品种中最高的，达到(1.620±0.114)U/mgprot。而同一属的宁夏红枸杞的羟自由基清除能力最弱。

表2 不同品种干果中的蛋白浓度和清除自由基能力Table 2 Protein concentration and free radical scavenging ability of different dried fruit

2.2 不同干果的抗超氧阴离子自由基能力对比

超氧阴离子和羟自由基一样，都具有较高的化学反应活性，是造成氧胁迫的重要原因[5]。本研究对7 种干果的抗超氧阴离子自由基的能力进行了评价（见表2），由表可知，黑果枸杞2 的抗超氧阴离子能力最强，达到了(2.210±0.142) U/gprot，其次是野生蓝莓果，达到了(1.968±0.100) U/gprot，然后是吐鲁番黑加仑葡萄干、黑果枸杞1、黑醋栗干果和桑葚干，最弱的是宁夏红枸杞。

2.3 不同干果的总抗氧化能力评价

通过ABTS 法和FRAP 法测定7 种干果的总抗氧化能力，结果如图1 所示。其中ABTS 法测得的总抗氧化能力从高到低依次为黑果枸杞1＞黑醋栗干果＞吐鲁番黑加仑葡萄干＞黑果枸杞2＞野生蓝莓果＞宁夏红枸杞＞桑葚干。而使用FRAP 法测得的总抗氧化能力与之有所不同，这7 种干果对Fe3+的还原能力依次是黑果枸杞1＞吐鲁番黑加仑葡萄干＞黑果枸杞2＞野生蓝莓果＞黑醋栗干果＞宁夏红枸杞＞桑葚干。从以上结果不难看出，黑果枸杞1 的总抗氧化能力在7 种干果中是最强的，而宁夏红枸杞和桑葚干是最弱的。

图1 不同干果的总抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of dried fruits

2.4 黑枸杞提取成分稳定性测定

基于黑果枸杞1 的总抗氧化能力在7 种干果中最强，本文继续分析了其提取溶液组成成分的色谱指纹图谱，考察其稳定性。以2%甲酸甲醇（即体积比甲酸：甲醇=2：98）为提取溶剂，将样品分别放置0、2、4、6、8、10 h 后通过HPLC 法检测黑枸杞提取液，得到黑枸杞的指纹图谱，其稳定性结果如图2 所示。由图中可知，黑枸杞的指纹图谱没有明显变化，这说明黑枸杞提取物比较稳定。

图2 黑枸杞指纹图谱稳定性Fig.2 Fingerprint stability of Lycium ruthenicum Murr

3 结论

本研究测定了7 种干果羟自由基清除能力、抗超氧阴离子自由基能力及总抗氧化能力，结果发现，7 种干果都有良好的抗氧化活性，但差异较大。其中青海黑果枸杞对ABTS 自由基和羟自由基的清除能力最强，而对超氧阴离子的清除能力不及宁夏黑果枸杞、野生蓝莓果和吐鲁番黑加仑葡萄干。在供试的7 种干果中，宁夏黑果枸杞清除超氧阴离子能力最强，但是清除羟自由基和ABTS 自由基的能力不如青海黑果枸杞。

试验还发现不同方法测定所得的总抗氧化能力是不同的。在ABTS 测试中，总抗氧化能力为黑醋栗干果＞吐鲁番黑加仑葡萄干＞宁夏黑果枸杞＞野生蓝莓果。但在FRAP 测试中，总抗氧化活性能力对比则为吐鲁番黑加仑葡萄干＞宁夏黑果枸杞＞野生蓝莓果＞黑醋栗干果。两者差异明显，这说明不同的测定方法对总抗氧化能力的结果有较大影响。可见，为了更好地测定和评价抗氧化能力，建立一套完整的评价体系是必不可少的。

综合4 种抗氧化能力的测定结果，可以得出，青海黑果枸杞在抑制羟自由基能力和总抗氧化能力方面都是最强的，说明青海黑果枸杞的抗氧化能力相对于其他干果来说十分突出，这可能是由于黑果枸杞中含有大量的花色苷，具有很高的药用开发价值[14]。相反，宁夏红枸杞和桑葚干是7 种干果中抗氧化能力最弱的。