CDK4/6抑制剂治疗三阴性乳腺癌的研究进展

朱秀之，陈 力，纪 磊，高 雨，王中华

复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科，上海市乳腺肿瘤重点实验室，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一类雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均阴性的乳腺癌亚型。目前TNBC缺乏特异性的治疗靶点，相较于其他亚型，其远处复发风险较高，预后较差［1-2］。国内外针对TNBC基因表达谱差异已鉴定出不同的亚群［3-4］。在中国，Liu等［5］采用人转录组芯片技术，将TNBC分为免疫调节亚型（immunomodulatory subtype，IM）、腔内雄激素受体亚型（luminal androgen receptor subtype，LAR）、间充质样亚型（mesenchymal-like subtype，MES）和基底样及免疫抑制亚型（basal-like and immune suppressed subtype，BLIS）4个分型。分子谱研究揭示了TNBC的分子异质性，强调寻找靶向治疗生物标志物的重要性。

哺乳动物中细胞周期分G1、S、G2、M期共4期。细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）在细胞周期进程中发挥重要作用。其中，CDK4/6活化调控G1期到S期的转变［6］。CDK作为细胞周期调控机制的核心部分，是各种恶性肿瘤在发生、发展过程中所必需的，以其为作用靶点的CDK抑制剂是近年来研究抗肿瘤药物的热点。

靶向细胞周期治疗的CDK4/6抑制剂对ER阳性的晚期乳腺癌患者疗效显著［7］，有望为TNBC患者提供新的治疗方向。但是由于缺乏统一的靶向患者筛选标准和疗效评价因子，迄今为止，CDK4/6抑制剂在TNBC患者中的疗效并不确切。本文总结TNBC中CDK4/6抑制剂的作用机制及可能相关的联系通路，在基础实验水平和临床试验水平，对药物联合治疗及疗效评价分子进行综述，旨在探讨CDK4/6抑制剂在TNBC治疗中的应用前景及优化手段。

1 CDK4/6抑制剂

1.1 CDK4/6在细胞周期调节中的信号通路

细胞有丝分裂周期是一个高度协调的过程，关键取决于细胞周期检查点控制［8］。CDK4/6是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控着G1期关键检查点，在乳腺癌细胞中磷酸化结合相应的细胞周期蛋白，形成的cyclin D-CDK4/6复合体介导视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化，引发Rb蛋白结构改变，继而释放转录因子E2F。E2F结合于DNA并促进G1期到S期进程的关键基因的转录和增殖蛋白的合成释放，启动DNA复制［9］。

Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信号通路受多方面联合调控。根据细胞类型的不同，cyclin D可以是cyclin D1、D2或D3。Cyclin D的正确合成和定位影响CDK4/6的活性［10］。此外，CDK抑制因子2（CDK inhibitor 2，CDKN2）基因家族（如CDKN2A、CDKN2B）编码产生CDK4/6抑制因子INK4家族（如p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d），竞争性结合CDK并抑制cyclin D-CDK4/6复合物的形成［11］。Rb蛋白被CDK4/6在多个位点磷酸化，可联合其他Rb家族成员p107和p130共同抑制细胞在G1早期的扩增。该通路持续激活的原因主要包括CDK4/6的富集、cyclin D1编码基因CCND1的扩增及p16INK4A基因的缺失等。

1.2 CDK4/6抑制剂在乳腺癌中的应用

目前数据显示，乳腺癌中cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F轴异常调节广泛存在，并且可能是乳腺癌发生的早期步骤［12］，包括cyclin D1的富集、抑制剂p16的缺失、Rb蛋白磷酸化水平的提高等。有研究显示，在激素受体（hormone receptor，HR）阳性的乳腺癌中，29%～58%存在cyclin D1过表达或扩增，14%～25%存在CDK4过表达；在BLIS中发现CDKN2A的高表达和细胞周期蛋白E1的富集。另外，Rb的低表达、丢失和突变也更常见于BLIS［13］。在乳腺癌、非小细胞肺癌等［14］多种恶性肿瘤中均观察到了p16INK4A基因的缺失以及CCND1、CDK4、CDK6基因的扩增。此外，CDK4/6抑制剂还可能会激发免疫及阻断TNBC细胞的远处转移（肝、肺）［15］。

第一代CDK抑制剂flavopiridol（alvociclib）由于缺乏特异性，呈现出大剂量限制性毒性。对于进展性TNBC患者的UCN-01Ⅱ期临床试验，疗效依旧令人失望而未能成功应用于临床［16］。新一代的CDK4/6抑制剂经过改造以后，具有一定的特异性和可以耐受的不良反应，典型代表有palbociclib、ribociclib、abemaciclib等，目前多种CDK4/6抑制剂临床试验正在进行。2015年2月美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）根据PALOMA1［17］Ⅱ期研究批准palbociclib联合来曲唑一线治疗绝经后HR+/HER2-的晚期乳腺癌；此后又根据PALOMA3研究［18］批准palbociclib联合氟维司群治疗绝经后既往内分泌治疗失败的ER+/HER2-晚期乳腺癌。Abemaciclib于2017年9月正式获得美国FDA批准上市［19］。

2 CDK4/6抑制剂治疗TNBC的基础研究

TNBC作为一种异质性的疾病，其内在丰富的生物学特性决定了对CDK4/6抑制剂的不同疗效。研究发现部分TNBC细胞株对palbociclib表现出一定程度的敏感性，甚至表现为明显的生长抑制，更有研究表明palbociclib疗效与ER或HER2的状态无直接相关［20］。

2.1 CDK4/6抑制剂对TNBC的选择性作用

以往研究发现，Rb基因高表达的TNBC细胞株对CDK4/6抑制剂palbociclib敏感并阻滞于G1期，Rb基因突变或低表达的TNBC细胞株则观察不到细胞周期阻滞现象［21］。Liu等［22］在TNBC研究中也证明在palbociclib治疗中，Rb与雄激素受体（androgen receptor，AR）表达状态都是不可或缺的。随后的临床回顾性研究也发现TNBC患者AR/Rb双强表达与总生存率显著相关，提出AR/Rb双阳性的TNBC患者适合palbociclib治疗。然而现有研究缺乏完整的临床数据来支持Rb和AR之间可能的相关性，关于AR和Rb在TNBC中的具体作用机制还不清楚，需要更深入研究来探讨两者的生物学联系。

Asghar等［23］用palbociclib作用于12个Rb基因野生型的TNBC细胞系，发现TNBC中LAR对CDK4/6抑制剂表现出高度敏感性。Palbociclib敏感的LAR癌细胞通常在有丝分裂后进入CDK2低表达的静止状态，需要CDK4/6磷酸化Rb才可以通过细胞周期限制点［6］；相反，部分基底样TNBC细胞经常进入CDK2高表达的增殖状态，不需要CDK4/6绕过该限制点，分裂时间更短，因此对palbociclib治疗具有耐药性。以往研究已经证明细胞周期蛋白E在促进CDK2高表达的同时，结合并激活CDK2，形成的复合物对CDK4/6抑制剂抵抗［24］，这在一定程度上解释了基底样和潜在的许多其他TNBC类型对CDK4/6抑制具有的耐药性，也表明细胞周期蛋白E在RNA或蛋白水平上的表达有可能作为乳腺癌中CDK4/6耐药的预测生物标志物。

2.2 CDK4/6抑制剂联合抗雄激素治疗TNBC

恩杂鲁胺（enzalutamide）是第二代AR拮抗剂，相较第一代，对AR亲和力更高［25］，已被美国FDA批准用于治疗晚期耐去势或耐化疗前列腺癌患者［26］。除了前列腺癌，近年来的证据表明，enzalutamide对TNBC也有抗癌作用，这意味着靶向AR可能是TNBC的一种良好策略［27］。在TNBC中，palbociclib联合enzalutamide可增强AR/Rb双阳性TNBC细胞的抑制作用，诱导细胞G1期阻滞，而对其阴性的TNBC细胞抑制作用不明显［22］。

越来越多的研究发现，enzalutamide联合palbociclib可有效阻滞AR/Rb双阳性TNBC的生长，提示AR和Rb的共表达可能是palbociclib联合enzalutamide联合治疗TNBC的生物标志物，为选择CDK4/6抑制剂联合AR拮抗剂治疗提供了依据。

2.3 CDK4/6抑制剂联合PI3Ka抑制剂治疗TNBC

在LAR和间充质干细胞亚型（mesenchymal stem-like，MSL）等非基底亚型TNBC中，富含PI3K催化亚基PIK3CA基因的激活突变［28］。研究发现，PI3K抑制剂、mTOR抑制剂与palbociclib在PIK3CA突变的细胞系中都存在协同作用［23，29］。与单一治疗相比，PI3Ka和CDK4/6双重阻断对多种Rb基因野生型TNBC模型的协同效应表现在抑制TNBC细胞糖代谢［30］，显著增加TNBC细胞系的凋亡、周期阻滞、肿瘤免疫原性和产生免疫原性细胞死亡。在同源TNBC小鼠模型中，PI3Ka和CDK4/6联合抑制显著增加了肿瘤浸润T淋巴细胞的活化和细胞毒性［31］。

进一步研究发现，PI3K抑制剂降低了有丝分裂后CDK2的活性，造成依赖CDK4/6活性来启动细胞周期的细胞内微环境。同时，药物抑制CDK4/6导致cyclin D1聚积并引发AKT信号上调，cyclin D1可以通过非经典途径激活CDK2［32-33］。联合抑制CDK4/6活性和PI3KAKT-mTOR轴可以防止有丝分裂上游信号上调导致的细胞反馈性增殖，为TNBC提供一种新的治疗思路，此类药物组合有可能进一步扩大对CDK4/6抑制敏感的亚型。

2.4 CDK4/6抑制剂联合免疫检查点抑制剂治疗TNBC

Goel等［34］通过乳腺癌小鼠模型研究发现，CDK4/6抑制剂在诱导肿瘤细胞周期阻滞的同时，很大程度上促进了机体抗肿瘤免疫，表现为增强肿瘤抗原的呈现、细胞毒性T细胞识别和抑制负性免疫调节的T细胞增殖。在一项最新研究中，CDK4/6抑制剂体内可通过阻止cyclin D-CDK4介导的斑点型POZ蛋白磷酸化，提高PD-L1蛋白水平，揭示细胞周期激酶调控PD-L1蛋白稳定性的新分子机制，提出CDK4/6抑制剂联合PD-1/PD-L1免疫检查点阻断在提高人类癌症疗效的潜力［35］，为CDK4/6抑制剂与免疫疗法作为抗癌治疗的新组合方案提供了理论依据。进一步研究发现，联合治疗组（PI3Ka抑制剂、CDK4/6抑制剂、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体）在小鼠体内诱导建立的TNBC肿瘤中，显著增加肿瘤的免疫原性和T细胞毒性，使肿瘤消退有效且持久（＞1年），总生存期明显优于其他治疗组［31］。

2.5 CDK4/6抑制剂联合其他药物治疗TNBC

Foidart等［36］研究发现，在膜4型基质金属蛋白酶、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）与Rb三者共表达的TNBC中，对CDK4/6抑制剂palbociclib与抗EGFR的erlotinib联合作用具有很强的敏感性，并提出三者生物标志物可以作为筛选CDK4/6抑制剂敏感的标志物。

现阶段，TNBC患者的主要治疗手段为DNA化疗，包含蒽环类、紫杉类和铂类药物等。Dean等［37］研究表明，在Rb高表达的TNBC中，紫杉烷类和蒽环类药物的细胞毒性作用常与CDK4/6抑制剂的细胞周期抑制作用相拮抗，阻止DNA损伤和细胞死亡诱导；在Rb突变的TNBC中，palbociclib单药无明显作用，且联合化疗药物并不改善预后［38］。CDK4/6抑制剂联合化疗在拮抗细胞毒性的同时，增加易出错的DNA修复机制，这可能有助于疾病的进展。

2.6 CDK4/6抑制剂在TNBC中的耐药机制

Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信号通路功能的失调将直接影响CDK4/6抑制剂的疗效。结合CDK4/6抑制剂的作用机制和上文相关的基础实验，可以将TNBC的耐药机制归纳为：①细胞内cyclin E-CDK2的富集［23］，使细胞周期绕过依赖cyclin D-CDK4/6的限制点，而出现依赖于cyclin E-CDK2的增殖分裂，TNBC富含cyclin E1，CDK4/6抑制剂单药治疗的固有耐药性已被报道［39-40］，而TNBC中的LAR存在分裂后cyclin E-CDK2低浓度而对CDK4/6抑制剂敏感。②Rb基因突变，30%的TNBC表现出Rb肿瘤抑制因子的功能丧失［41］，导致下游E2F转录因子释放失控而耐药，此外，Rb mRNA低转录的细胞往往对CDK4/6抑制剂较不敏感［40］。③细胞自身高表达抑制因子INK4家族，内源性抑制CDK4/6，在P16INK4a修饰后的乳腺癌模型中，palbociclib治疗对其无明显疗效［33］，Rb和P16INK4a表达水平可联合预测乳腺癌患者对于CDK4/6的治疗反应。④CDK6基因的扩增及细胞内高表达CCND1，使其信号通路高度活化而难以抑制。⑤其他基因的突变，包括异常的MYC癌基因、TP53［42］、PDK1［43］、FGFR1［44］等，这些基因的变异均可导致对CDK4/6抑制剂敏感性降低。

3 CDK4/6抑制剂治疗TNBC的临床研究

CDK4/6抑制剂palbociclib（PD0332991）和ribociclib（LEE011）联合内分泌治疗在晚期ER+/HER2-乳腺癌临床试验的突出疗效，已被美国FDA批准用于治疗此类患者［10］。安全性分析结果显示［45］，palbociclib试验组中性粒细胞减少、白细胞减少、贫血及乏力等不良反应发生率高。Abemaciclib常见的不良反应为消化道症状，如恶心、腹泻，另外还包括中性粒细胞减少、静脉血栓栓塞和肝损害［19］。同时，基于CDK4/6抑制剂在TNBC相关的众多基础实验中取得的重大发现，近年来CDK4/6抑制剂在TNBC的临床试验也正在进行中（表1）。

目前，CDK4/6抑制剂在TNBC的临床试验，已经完成的仅有一项（NCT01037790），共入组4例Rb阳性的TNBC患者，经palbociclib单药治疗后，其中3例疾病进展（progressive disease，PD），1例疾病稳定（stable disease，SD）［39］。在一项由Ruth O'Rega团队负责的I/Ⅱ期非随机多中心研究（NCT03090165，2017年3月2日—2019年9月）中，CDK4/6抑制剂ribociclib（LEE011）与AR抑制剂比卡鲁胺（bicalutamide）联合治疗晚期AR阳性的TNBC。邵志敏教授团队下一项Ib/Ⅱ期开放标签的综合性研究（NCT03805399，2018年7月17日—2022年6月1日），对CDK4/6抑制剂联合AR抑制剂治疗的患者，进行了更为精准的筛选，此类患者入组标准为Rb基因野生型、CCDN1扩增或CDKN2A拷贝数丢失的LAR。类似的临床试验还有，CDK4/6抑制剂trilaciclib（G1T28）治疗接受吉西他滨和卡铂化疗后转移性TNBC患者Ⅱ期研究（NCT02978716，2017年2月7日—2020年2月）以及palbociclib联合bicalutamide治疗AR阳性的转移性乳腺癌的I/Ⅱ期临床试验（NCT02605486，2015年11月11日—2020年11月）和有关TNBC的Ⅱ期临床试验（NCT03519178，2018年7月—2021年12月）。这些临床试验的药代动力学结果、PFS、ORR、OS、CBR等值得我们期待。

表1 CDK4/6抑制剂治疗TNBC的临床试验Tab.1 Clinical trial of CDK4/6 inhibitor in TNBC

4 总结和展望

从现有的研究来看，CDK4/6抑制剂对肿瘤细胞的抑制作用，不仅局限于细胞周期的阻滞，还包括细胞凋亡的诱导、肿瘤细胞激酶信号的改变、免疫调节的变化及众多信号转导通路的改变，这使得CDK4/6抑制剂的应用和药物配伍也不断扩大。在TNBC中，CDK4/6抑制剂单用疗效十分有限，但其联合用药在增强药物疗效的同时，也扩大了受益人群，更彰显优势［46］。在众多联合治疗方案中，CDK4/6抑制剂联合雄激素受体阻断可能成为TNBC中LAR的一种有效的选择性治疗，但仍需等待临床试验的验证。尽管目前palbociclib、ribociclib、abemaciclib这3种CDK4/6抑制剂在临床试验中疗效可观，但是现有的CDK6、CCND1、cyclin E-CDK2、INK4家族、Rb、激素受体等评估条件，除广泛认可的激素受体ER+外，与三者疗效相关的其他生物标志物尚无统一定论。因此，寻找CDK4/6抑制剂的疗效预测分子，指导合理的联合用药方案，挖掘潜在的TNBC患者，进一步实现个体精准化治疗，是未来努力的方向。