沉默GOLPH3基因表达逆转人结肠癌细胞顺铂耐药的研究

王春晓，邱成志，洪钟时

福建医科大学附属第二医院普外科，福建 泉州 362000

中国结直肠癌每年新发病例约37.5万，每年死亡病例约19.1万［1］，其死亡率的变化趋势有性别及年龄差异，男性居民呈上升趋势，女性居民呈小幅度下降趋势；高年龄组居民死亡率呈上升趋势［2］。由于结直肠癌发病隐匿的特点再加上健康体检的不到位，60%～70%的患者在确诊时已经处于中晚期［3］，因此，辅助化学治疗仍是结直肠癌重要的治疗措施。以铂类和氟尿嘧啶为基础的FOLFOX方案是目前结直肠癌的一线用药。但化疗过程中易产生化疗耐药，因此，研究结直肠癌的化疗耐药相关机制并逆转肿瘤细胞耐药至关重要。

近年来研究表明，高尔基磷酸化蛋白3（Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）基因可促进癌细胞的生长、增殖并抑制凋亡，是一种新的原癌基因［4-5］，本实验采用siRNA干扰技术，探讨沉默GOLPH3基因逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的耐药机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及细胞株

人结肠癌细胞株HT29购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，TRIzol、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录酶购自立陶宛Fermentus公司，SYBR Ex Taq试剂盒购自日本Takara公司，siRNA靶向GOLPH3（GCUUGCUUAAUCATGGTTAT）购自上海吉玛制药技术有限公司，Opti-MEM购自上海拓然生物科技有限公司，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自美国Sigma公司，BCA蛋白定量试剂盒购自上海伟进生物科技有限公司，兔抗人GOLPH3多克隆抗体购自英国Abcam公司（ab98023），兔抗人P-gp单克隆抗体购自英国Abcam公司（ab170904)），ERK1/2购自英国Abcam公司（ab17942），pERK1/2购自英国Abcam公司（ab201015），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购自南京碧云天生物技术有限公司（A0208），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物根据基因全序列设计并由上海生工生物工程有限公司合成，细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）1/2抑制剂PD98059购自美国Cell Signaling Technology公司（9900S），顺铂购自齐鲁制药有限公司，GOLPH3购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将HT29人结肠癌细胞培养在RPMI-1640+10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养基中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、95%饱和湿度环境的细胞培养箱中进行培养。

1.2.2 细胞分组

将结肠癌细胞分为5组。①对照组：HT29细胞；②转染组：用siRNA-GOLPH3转染的HT29细胞组（采用脂质体法，参照说明书用50 nmol/L siRNA转染HT29细胞）；③实验组1：顺铂处理后的HT29细胞组；④实验组2：顺铂处理后的siRNA-GOLPH3转染细胞组；⑤实验组3：顺铂和ERK1/2抑制剂PD98059（浓度为50 μmol/L）处理后的HT29细胞组。各实验组细胞均在含10 μmol/L顺铂的培养基中分别培养24 h。

1.2.3 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）检测结肠癌细胞株HT29转染前后GOLPH3 mRNA的表达

用RT FQ-PCR检测对照组及转染组的GOLPH3 mRNA的表达。用TRIzol裂解法提取结肠癌细胞株总RNA，溶于适量RNase-free的超纯水中，用分光光度计检测R NA浓度。将R N A 反转录为c DNA，以GAPDH作为内参，进行RT FQ-PCR。G OL PH 3上游引物：5'-AGGGCGACTCCA AGGA A A-3'，下游引物：5'-TGATGTGTAACCCTCGCG-3'，产物长度：83bp；18 Sr RNA 上游引物：5'-GGTCATAAGCTTGCGTTGATTAAG-3'，下游引物：5'-CTACGGAAACCTTGTTAC GACTTT-3'，产物长度：189 bp。反应条件：95 ℃预变性20 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共循环45次，在退火阶段检测荧光；融解曲线条件为50 ℃ 15 s，51 ℃升温至99 ℃，每升高1 ℃停留5 s；数据分析通过相对定量-ΔΔCT法进行。

1.2.4 MTT法检测各组细胞增殖

各组细胞经胰酶消化后，接种于96孔板上，每孔加100 μL（1×105个细胞），贴壁培养24 h后每组设4个复孔及对照孔，对照孔仅加入细胞不做处理。培养48 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 10 μL培养4 h，弃培养液。每孔加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，避光振荡混匀，结晶溶解后用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度（D）值，以上步骤重复3次，取平均值。

1.2.5 克隆形成实验检测各组细胞增殖能力

①血球计数板计数细胞，6孔板的每个孔各接种不同处理类型的细胞1 000个；②每3 d换液1次，根据细胞种类不同，持续2周；③经常观察，待克隆长到肉眼可见，终止培养，PBS清洗1次；④甲醇固定20 min，PBS洗2遍；⑤0.5%结晶紫染液染色20 min；⑥PBS清洗3次，拍照计数；⑦以上步骤重复3次，取平均值。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测各组细胞株GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2等蛋白质的水平

将处于对数生长期的各组细胞，用PBS清洗1次，再将细胞溶解在RIPA裂解缓冲液中，在冰上作用20 min。用BCA法测定蛋白浓度，分别利用细胞裂解液提取的细胞总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），电泳后湿转至硝酸纤维素膜，含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭60 min，分别加入一抗GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2，4 ℃温育过夜；PBST漂洗20 min×3次；加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温温育1 h；PBST漂洗10 min×3次；ECL化学发光试剂检测。图像应用Image-J软件进行灰度分析，目的蛋白表达的相对强度=目的条带的灰度值/GAPDH条带的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HT29结肠癌细胞转染效果

2.1.1 siRNA-GOLPH3有效沉默人结肠癌细胞HT29中GOLPH3基因的表达

对照组HT29细胞GOLPH3 mRNA相对表达量为1.002±0.223，而转染组的GOLPH3 mRNA相对表达量为0.162±0.062，转染组较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；对照组和转染组中的GOLPH3蛋白相对表达量分别为1.003±0.094和0.099±0.112，转染组较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001，图1）。

图1 对照组与转染组中的GOLPH3 mRNA表达和蛋白水平Fig.1 The expression levels of GOLPH3 mRNA and protein in the control and transfection groups

2.1.2 HT29细胞转染siRNA-GOLPH3后增殖及克隆形成能力均显著降低

MTT法检测HT29细胞增殖显示，转染组细胞的D490值为0.715±0.074，对照组D490值为1.007±0.130，转染组显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；平板克隆形成实验结果显示，转染组的集落数为341.700±54.930，对照组的细胞集落数为463.300±43.020，转染组显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 对照组与转染组癌细胞增殖与克隆形成能力Fig.2 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in the transfection group and the control group

2.2 沉默GOLPH3基因表达可提高顺铂抑制HT29结肠癌细胞增殖与克隆形成能力

MTT法检测对照组、实验组1和实验组2中细胞的D490值分别为1.000±0.127、0.746±0.085和0.236±0.071，实验组1和实验组2的D490值均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001），同时，实验组2的D490值显著低于实验组1，差异有统计学意义（P＜0.001）。克隆形成实验显示，对照组、实验组1和实验组2细胞的集落数分别为604.700±39.700、442.300±34.270和126.300±45.650，实验组1和实验组2的细胞集落数均显著低于对照组的细胞集落数，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001），同时，实验组2的细胞集落数显著低于实验组1的细胞集落数，差异有统计学意义（P＜0.001，图3）。

2.3 沉默GOLPH3基因表达逆转HT29细胞对顺铂化疗耐药的机制

2.3.1 沉默GOLPH3基因表达可下调pERK1/2的表达而抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）信号通路

在顺铂处理下，实验组2的GOLPH3、P-gp的蛋白表达量分别为0.249±0.084、1.842±0.383，而实验组1的GOLPH3、P-gp的蛋白表达量分别为2.734±0.440、4.269±0.454，实验组2的GOLPH3、P-gp的蛋白表达量较实验组1均同步显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；同时，ERK1/2蛋白在实验组1、2及对照组均无显著差异，而实验组2的pERK1/2表达量为1.124±0.410，显著低于实验组1的4.353±0.956，差异有统计学意义（P＜0.01，图4，表1）。

2.3.2 阻断MAPK/ERK信号通路后可逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的耐药

在上述实验基础上，顺铂处理并采用MAPK/ERK信号通路阻滞剂（PD98059），实验组3中P-gp的蛋白相对表达量为1.525±0.189，比实验组1的3.430±0.335显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，图5）。

图3 实验组1、实验组2及对照组癌细胞增殖与克隆形成能力Fig.3 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in experimental group 1,experimental group 2 and the control group

图4 顺铂处理下对照组、实验组1和实验组2细胞相关蛋白的表达Fig.4 Expression levels of the related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2 with cisplatin treatment

表1 对照组、实验组1和实验组2中相关蛋白的相对表达量Tab.1 The relative expression levels of related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2

图5 顺铂处理下对照组、实验组1和实验组3中P-gp蛋白表达Fig.5 Expression level of P-gp protein in the control group,experimental group 1 and experimental group 3 with cisplatin treatment

3 讨 论

顺铂作为铂类化疗药物的代表，癌细胞对其耐药仍是临床难题，其机制包括多方面［6］，如基因表达异常等。GOLPH3基因是近年来新发现的癌基因，定位于5p13上，编码高尔基体复合物的一种约34×103的相关蛋白质。研究表明，人结直肠癌组织中GOLPH3蛋白存在过表达，与细胞分化差、淋巴结转移、分期晚、增殖等呈正相关，与凋亡呈负相关，与结直肠癌组织血管生成有关，可激活Wnt细胞信号转导通路［7-10］。因此本研究旨在探讨GOLPH3基因表达促进结肠癌细胞对顺铂的耐药。

本研究显示，在顺铂处理下，HT29结肠癌细胞沉默GOLPH3基因表达后，其癌细胞的增殖和克隆形成能力明显抑制，说明GOLPH3基因参与HT29细胞的化疗耐药，表明下调GOLPH3基因表达可提高HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的敏感性。这可能与GOLPH3基因高表达可激活PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-catenin细胞内信号通路有关，这些信号通路下游靶基因如MDR1、MRP1、c-myc等可参与癌细胞对铂类化疗药物耐药［11-14］。同时有研究证实，非小细胞肺癌对顺铂耐药与PI3K/AKT信号转导通路的异常活化有关［15］。GOLPH3基因高表达是否存在激活其他细胞信号通路如MAPK/ERK参与顺铂化疗的耐药，有待进一步研究。

已有研究报道，MAPK/ERK1/2信号通路过度激活与许多肿瘤对铂类耐药性的产生存在明显的相关性，其作用机制可能是通过调控耐药相关基因和蛋白如P-gp的表达［16］。P-gp是由多药耐药基因编码的一种跨膜糖蛋白，是细胞产生多药耐药的分子基础［17］。李敏等［18］的研究表明，白头翁皂苷B4能逆转人结肠癌奥沙利铂耐药细胞（LoVo/L-OHP）对奥沙利铂的耐药，其机制可能与降低P-gp表达有关。

本研究证实，在顺铂处理下，下调结肠癌细胞GOLPH3表达，P-gp、pERK1/2蛋白表达量同步明显下降，而阻滞MAPK/ERK信号通路活性，可显著降低HT29细胞P-gp蛋白表达，表明GOLPH3基因高表达促进HT29细胞对顺铂的化疗耐药与激活MAPK/ERK信号通路相关，沉默GOLPH3基因表达能在一定程度上逆转人结肠癌细胞对顺铂的耐药。这主要是GOLPH3基因能引起ERK1/2磷酸化，上调P-gp的表达而产生耐药性。

综上所述，沉默GOLPH3基因的表达可在一定程度上通过抑制MAPK/ERK信号通路活性逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的化疗耐药。