FGFR3和PIK3CA基因突变影响膀胱癌的预后

钟 键，金正贤，卞卫星，仇佳星，侯建全

1.南京中医药大学张家港附属医院泌尿外科，江苏 苏州 215600；2.苏州大学附属第一医院泌尿外科，江苏 苏州 215006

膀胱癌是泌尿外科常见的肿瘤之一，90%的膀胱癌是移行细胞癌，呈乳头状，术后易复发，但很少发展到浸润性肿瘤，成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）和磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基ɑ（phosphoinositide 3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）基因突变在浅表乳头状膀胱肿瘤中常见，并且FGFR3基因突变预后更好，但易复发［1］。膀胱癌的发生、发展不仅有PI3K/AKT信号通路的参与，也有上游调节因子FGFR3的参与［2］。因此本研究对膀胱癌患者的膀胱癌组织进行FGFR3和PIK3CA基因突变和蛋白表达研究，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

2014年2月—2017年12月于南京中医药大学张家港附属医院泌尿外科行手术治疗的63例膀胱癌患者，均为移行细胞癌，男性53例，女性10例，吸烟史52例，低级别尿路上皮癌41例，高级别尿上皮癌22例，根据国际抗癌协会的2002年第6版TNM分期法，TaN0M0期27例，T1N0M0期8例，T2aN0M0期16例，T2bN0M0期8例，T3aN0M0期3例，T3bN0M0期1例，无T4期病例。术前均未进行放化疗和免疫治疗。经尿道膀胱肿瘤等离子电切术44例，术后均予以吡柔比星40 mg（深圳万乐药业有限公司）膀胱灌注，共19次，定期复查膀胱镜和胸腹部CT。根治性膀胱切除+尿流改道术19例，术后予以4个疗程的GC方案（吉西他滨+顺铂）化疗，定期复查胸腹部CT。所有标本在进行研究前由南京中医药大学张家港附属医院病理科2名主任医师职称的病理科医师再次阅片确诊，保证病理学诊断的一致性，剔除诊断不一致的病例。

1.2 随访

全组患者的随访起点为手术开始时，随访终点为2018年3月31日。复发指临床及影像学检查显示膀胱内再发肿瘤。远处转移指临床及影像学检查显示有远处相关疾病。无进展生存期（progression-free survival，PFS）指从手术后的第1天开始至第1次复发或转移的时间，总生存期（overall survival，OS）指从手术后的第1天开始至死亡或末次随访的时间，删截点包括：①死于其他疾病；② 失访等事件。时间以月为单位，随访期间因膀胱癌死亡6例，1例死于急性心肌梗死，1例失访。本研究获得南京中医药大学张家港附属医院伦理委员会的批准。

1.3 免疫组织化学

术后取新鲜肿瘤组织，10%中性福尔马林溶液固定24 h，采用5 μm厚的蜡块连续组织切片，1张做苏木精-伊红染色以核实诊断，另1张做FGFR3免疫组织化学染色，1张PBS做一抗空白对照。FGFR3和PIK3CA单克隆抗体均购自英国Abcam公司，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学操作步骤按说明书进行操作。FGFR3和PIK3CA一抗均为工作液，稀释浓度分布为1∶50和1∶100，经显色、复染、脱水、透明后封片。

蛋白表达阳性判定标准：FGFR3蛋白表达主要定位于细胞膜或细胞质，表现为黄色或棕黄色着色。将每张免疫组织化学切片置于高倍镜下（×400），随机选取5个不同视野，肿瘤细胞中出现黄色或棕黄色着色即为阳性蛋白表达，无着色为阴性。

1.4 突变检测

从每例包埋石蜡组织块中切取组织，采用OMEGA试剂盒法分离和提取组织DNA，采用定量分析法评价DNA的质量，直到提取DNA的质量合格。以FGFR3基因热点突变外显子7、10和15为模板设计引物，PIK3CA基因热点突变外显子9和20为模板设计引物，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增DNA（20.00 μL PCR扩增体系：1.00 μL肿瘤DNA，0.15 μL Taq高保真酶，引物0.80 μL，dNTP 0.80 μL，Mg2+0.80 mL，ddH2O 14.45 μL，10×buffer 2.00 μL）。反应条件：95 ℃预变性7.0 min，94 ℃变性1.0 min，62 ℃退火1.5 min（外显子15）和61 ℃退火1.5 min（外显子7和10），72 ℃延伸1 min，40个循环后，最后72 ℃延伸7 min。扩增产物进行电泳分离，并对产物进行纯化，采用Sanger基因测序技术对产物测序，利用Chromas软件进行基因突变判读。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件包进行统计分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法。OS和PFS用Kaplan-Meier曲线及log-rank检验分析，多参数COX回归分析影响膀胱癌预后因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访及突变检测结果

63例膀胱癌患者中，术后13例复发，11例FGFR3基因突变（17.46%），蛋白表达21例（33.33%），5例PIK3CA基因突变（7.94%），蛋白表达35例（55.56%）。

2.2 FGFR3和PIK3CA基因突变与临床各参数的关系

FGFR3基因突变与性别、吸烟史、肿瘤大小、数目、分期、分级无显著相关性（P＞0.05），而FGFR3基因突变与年龄、术后肿瘤是否复发显著相关（P＜0.05，表1）。PIK3CA基因突变与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、数目、分期分级、肿瘤复发均无显著相关性（P＞0.05，表1）。

表1 FGFR3和PIK3CA基因突变与临床各参数的关系Tab.1 The relationship between clinical data and mutations of FGFR3 and PIK3CA

2.3 FGFR3和PIK3CA基因突变的关系

FGFR3mut/PIK3CAwt组基因突变在各分组中分别为3例、2例、4例，FGFR3mut/PIK3CAmut组基因突变在pTa/T1low组中为2例，FGFR3wt/PIK3CAmut组基因突变在pTa/T1high和≥T2组中分别为1例和2例。FGFR3mut和PIK3CAmut单基因突变12例（19.05%），联合突变2例（3.17%）。11例FGFR3mut中2例PIK3CAmut，52例FGFR3wt中3例PIK3CAmut，两者比较，差异有统计学意义（χ2=4.61，P=0.03，表2）。

表2 FGFR3和PIK3CA基因突变的关系Tab.2 The relationship between FGFR3 and PIK3CA mutations

2.4 FGFR3和PIK3CA基因突变对OS和PFS的影响

FGFR3mut和FGFR3wt的OS分别为47.00和48.26个月，差异无统计学意义（P=0.675，图1A）；FGFR3mut和FGFR3wt的PFS分别为29.13和46.25个月，差异有统计学意义（P=0.021，图1B）。PIK3CAmut和PIK3CAwt的OS分别为32.00和26.07个月，差异无统计学意义（P=0.435，图2A），PIK3CAmut和PIK3CAwt的PFS分别为28.67和26.32个月，差异无统计学意义（P=0.204，图2B）。

图1 FGFR3基因突变型和野生型OS和PFS的Kaplan-Meier曲线Fig.l The Kaplan-Meier curves of OS and PFS for patients with mutant and wild-tye FGFR3

图2 PIK3CA基因突变型和野生型OSF和PFS的Kaplan-Meier曲线Fig.2 The Kaplan-Meier curves of OS and PFS for patients with mutant and wild-tye PIK3CA

2.5 多参数COX回归分析影响膀胱癌的OS和PFS的因素

COX多参数分析影响膀胱癌预后的因素，病理学分级是影响膀胱癌预后OS的危险因素，FGFR3和PIK3CA基因突变和蛋白表达均不是影响OS的独立因素（表3）；吸烟史和FGFR3基因突变则是影响膀胱癌患者预后PFS的危险因素（表4）。

表3 多参数COX回归分析影响膀胱癌OS的因素Tab.3 A multivariate analysis for the prognostic factors of OS in bladder cancer

表4 多参数COX回归分析影响膀胱癌PFS的因素Tab.4 A multivariate analysis for the prognostic factors of PFS in bladder cancer

3 讨 论

膀胱癌是全球第10位常见的恶性肿瘤，发病率正随着社会经济的发展而逐年增加，但死亡率却逐年降低，并且全球排名也在不断下降，主要是由于其他恶性肿瘤快速增长，如前列腺癌和乳癌等［3-4］。膀胱癌多见于男性，男性发病率是女性的4倍，除暴露于化学和污染因素外，吸烟是最主要的危险因素。约30%的初发膀胱癌进展为肌层浸润性膀胱癌而行根治术，然而术后2年约50%的患者发生转移［5］。虽然基于顺铂的新辅助化疗能更好地控制肿瘤和提高总生存率［6］，但迄今为止，还没有生物标志物来预测肿瘤进展，大多数采用临床症状联合影像学数据来评估疗效。因此，需要可靠的标志物来评估肿瘤的复发和转移，而越来越多的证据表明，膀胱癌的发生、发展是由基因改变累积到质变而发生。目前，欧美研究者认为FGFR3基因突变与低级别低分期膀胱癌有关［1］，并在肿瘤进展的早期也可发生基因突变，而PIK3CA基因突变激活PI3K/AKT信号通路促进细胞癌变［7］，但国内尚缺乏相应的研究，因此，本课题组在膀胱癌中进行了初步研究。

FGFR3是酪氨酸激酶受体基因家族成员之一，FGFR3基因突变和受体功能异常，引起机体生长、发育异常，导致人体软骨发育不良等多种人类遗传性疾病。FGFR3基因编码酪氨酸激酶连接的细胞表面受体，基因突变导致受体组成性激活［8］。在低级别低分期膀胱癌中突变率达80%，在肌层浸润性膀胱癌中，突变率仅为10%～15%，在原位癌中则没有发现突变［9］。在本研究中，FGFR3基因突变率仅为17.46%，低于文献报道，推测可能与种族、检测方法、标本类型有关。本研究发现，FGFR3基因突变与年龄、肿瘤是否复发相关，提示高龄膀胱癌患者，肿瘤细胞生长相对活跃，但机体抵抗力低，即使术后辅助化疗，仍易复发。虽然FGFR3基因突变多见于低级别低分期膀胱癌，但差异无统计学意义，可能与种族和样本量等有关。因此需要进一步扩大样本量进行多中心研究。

PIK3CA基因是磷脂酰肌醇激酶-3家族关键的成员之一，负责调节细胞内信号转导通路，与细胞的增殖、黏附、分化、迁移等生物学行为密切相关［10］。PIK3CA基因突变导致PIK3CA蛋白过度表达，PI3K催化活性增强，PI3K/AKT信号通路异常激活，促进细胞癌变而肿瘤形成［11］。因此，PIK3CA在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用，是理想的治疗靶点。PIK3CA基因突变率在欧美人群中为13%～25%［12］，并且随着分级分期的增加，突变率降低。在本研究中仅为7.94%，可能与种族差异、群体多样性、检测方法等有关。PIK3CA基因突变随着肿瘤分级和分期的增加而降低，并且认为PIK3CA基因突变发生在膀胱癌的早期［13］，然而本研究显示，PIK3CA基因突变与肿瘤分级和分期等无关，提示PIK3CA在膀胱癌的发病机制中不扮演重要角色，与Juanpere等［14］的报道一致，PI3K信号通路通过不同的分子机制促进膀胱癌的进展［15］。本研究显示，在FGFR3基因突变型和野生型的膀胱癌中，PIK3CA基因突变更多见于FGFR3基因突变型膀胱癌，PIK3CA基因突变与FGFR3基因突变密切相关［14］。PI3K信号通路的激活有助于增强FGFR3突变型膀胱癌的恶性行为［1］，为联合靶向FGFR3-PI3K治疗膀胱癌奠定了基础［16］，虽然PI3K/AKT信号通路在膀胱癌中处于失调状态，但其不是膀胱癌的主要发病机制。

影响膀胱癌预后的因素很多，如肿瘤因素、手术因素、辅助治疗等，而FGFR3和PIK3CA基因突变对膀胱癌的预后预测作用仍然有争议。文献报道，FGFR3基因突变的膀胱癌预后更好［17］，甚至FGFR3基因突变能预测肌层浸润性膀胱癌术前新辅助化疗的疗效［18］，而Geelvink等［19］认为FGFR3基因突变不能预测肿瘤复发、进展等风险。PIK3CA基因突变的预后作用根据实体肿瘤的不同而不同，在结直肠癌或肺癌患者中预后不良［20-21］，而在食管癌或卵巢癌患者中则预后较好［22］，但在膀胱癌中则需要联合FGFR3才能评估PIK3CA的预后价值。本研究发现，病理学分级是影响膀胱癌OS的主要因素，而FGFR3和PIK3CA基因突变和蛋白表达并不是影响OS的主要因素。FGFR3基因突变和吸烟史则是影响PFS的主要因素，而且根据Kaplan-Meier生存分析，FGFR3基因突变的膀胱癌PFS更短，本研究显示，FGFR3基因突变是膀胱癌预后的一个不利因素，可将FGFR3基因突变作为膀胱癌高危因素分层的生物标志物，因此FGFR3基因突变的膀胱癌应该采用更加积极的治疗策略，术后应该缩短复查间隔时间［23］。相同的研究得出了不同的结果，可能是由于患者队列、样本大小、用于评估突变的方法或种族差异，因此仍然值得我们进行深入的研究。

因此，FGFR3基因突变是膀胱癌预后的不利因素，PIK3CA更易在FGFR3突变的膀胱癌中突变，可能促进FGFR3突变型膀胱癌的恶性行为。