miR-762在胰腺癌中的表达及对胰腺癌细胞生物学行为的影响

焦志凯，冯宁宁，张越山，康 希，杨宝明，李建坤，曹 恒，董 彪，付炯辉，王顺祥

河北医科大学第四医院肝胆外科，河北 石家庄 050011

胰腺癌是中国常见的恶性程度较高的消化道恶性肿瘤之一，危害极大［1-2］。因此，探索胰腺癌发生、发展的分子机制对于疾病防治具有重要的临床意义。miRNA是由18～22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，能够与靶基因3'非编码区特异性结合，从而在转录后水平调控靶基因表达。研究发现，多种miRNA在肿瘤组织中异常表达［3-4］。其中miR-762已被证实在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中高表达，通过调控靶基因表达参与细胞增殖、凋亡、侵袭转移等过程［5-6］。但miR-762在胰腺癌发生、发展中的作用报道较少。本研究检测了miR-762在胰腺癌组织和细胞株中的表达情况，并分析了miR-762在胰腺癌细胞增殖、侵袭转移中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 组织标本及细胞株

收集2016年1月—2019年1月于河北医科大学第四医院行胰腺癌根治术的胰腺癌组织标本35例（包括癌组织及距离其3～5 cm的癌旁组织），术后均经病理学检查确诊，且术前未接受放化疗。人胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、SW-1990和人正常胰腺上皮细胞HPDE购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、TRIzol购自美国Gibco公司；miR-762模拟物（mimics）、miR-762抑制物（inhibitors）及其阴性对照序列（scramble序列）购自上海吉凯制药技术有限公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）试剂盒、反转录试剂盒购自日本Takara公司；鼠抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）抗体购自美国Abcam公司。Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；7300型RTFQ-PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3 细胞培养

细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养。取对数生长期的细胞接种于6孔板，待细胞融合达80%时采用LipofectamineTM2000将miR-762 mimics、miR-762 inhibitors及其scramble序列分别转染至PANC-1细胞中，不进行转染的细胞为空白对照组。实验重复3次。

1.4 CCK-8实验检测细胞活性

细胞消化后制成单细胞悬液，以2×103个/孔的密度接种于96孔板，每孔200 μL。分别于培养0、1、2、3、4 d时进行CCK-8实验，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，测定450 nm处的吸光度（D450）值。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

转染48 h后收集细胞，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，重悬细胞，加入Annexin V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μL，37 ℃避光染色20 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

转染48 h后，各组细胞接种于6孔板，待细胞融合达100%时用10 μL枪头在培养板底部做一均匀划痕，PBS洗涤3次，加入含2%FBS的新鲜培养基，在倒置显微镜下观察划痕后即刻、48 h时的细胞迁移情况，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（划痕后即刻划痕宽度-48 h划痕宽度）/划痕后即刻划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.7 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

转染细胞48 h后，各组细胞制成1×105/mL的细胞悬液，取200 μL接种到预铺Matrigel基质胶的Transwell上室，下室加入200 μL含10%FBS的培养基，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h后，用棉签刮去基质胶和未穿膜细胞，多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞数，求平均值。实验重复3次。

1.8 RTFQ-PCR检测基因mRNA

TRIzol提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。取2 μL cDNA为模板，在ABI 7300型RTFQ-PCR仪上进行PCR扩增。U6为内参照基因，采用2-△△CT法定量目的基因mRNA相对表达量。miR-762及U6引物序列如下：miR-762上游引物5'-ACACGGGGCUGGGGCCGG GGCCGAGCGCCTC-3'，下游引物5'-CTCAGG GGCUGGGGCCGGGGCCGAGCCAGA-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。E-cadherin、N-cadherin、vimentin及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3'，下游引物5'-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3'；N-cadherin上游引物5'-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3'，下游引物5'-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3'；Vimentin上游引物5'-GAGA ACTTTGCCGT TGAAGC-3'，下游引物5'-GCTTCCTGTAGGTG GCAATC-3'；GAPDH上游引物5'-CTCTGCTCCT CCTGTTCGAC-3'，下游引物5'-GCGCCCAA TACGACCAAATC-3'。实验重复3次。

1.9 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达

转染48 h后，提取细胞总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，S D S-PA G E）分离后电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，10%脱脂奶粉封闭2.0 h，加入特异性一抗温育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗室温温育1.5 h，TBST洗膜3次。ECL化学发光法显色、定影，设GAPDH为内参照蛋白。实验重复3次。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-762在胰腺癌组织和细胞株中的表达

RTFQ-PCR结果显示，胰腺癌组织中miR-762 mRNA表达量为0.91±0.28，显著高于癌旁组织（0.32±0.08）（t=12.30，P=0.000）。胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、SW-1990中miR-762 mRNA的表达量分别为0.57±0.08、1.22±0.32、0.79±0.21、0.96±0.11，显著高于正常胰腺上皮细胞HPDE（0.31±0.08）（t=-4.61、-6.04、-4.67、12.03，P=0.010、0.004、0.010、0.000，图1）。

图1 miR-762在胰腺癌和正常胰腺上皮细胞中的表达Fig.1 Expression of miR-762 in pancreatic cancer and normal pancreatic epithelial cell lines

2.2 转染miR-762 mimics、miR-762 inhibitors对PANC-1细胞miR-762表达的影响

RTFQ-PCR结果显示，转染24 h后，空白对照组、阴性对照组、miR-762 mimics组、miR-762 inhibitors组miR-762 mRNA表达量分别为1.16±0.21、1.12±0.24、9.45±1.23、0.39±0.10。与阴性对照组比较，miR-762 mimics 组miR-762 mRNA表达量显著增加，miR-762 inhibitors组miR-762 mRNA表达量显著降低（t=-13.70、5.10，P=0.000、0.007，图2）。

2.3 miR-762对PANC-1细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，转染后第2～4天，与阴性对照组比较，miR-762 mimics组D450显著增加，miR-762 inhibitors组D450显著降低（P＜0.01，图3）。

图3 miR-762对PANC-1细胞增殖的影响（CCK-8实验）Fig.3 Effect of miR-762 on proliferation of PANC-1 cells (CCK-8 assay)

2.4 miR-762对PANC-1细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，转染48 h后，空白对照组、阴性对照组、miR-762 mimics组、miR-762 inhibitors组细胞凋亡率分别为（10.15±2.43）%、（10.00±1.95）%、（3.40±0.77）%、（22.64±3.71）%。与阴性对照组比较，miR-762 mimics组细胞凋亡率显著降低，miR-762 inhibitors组细胞凋亡率显著增加（t=7.95、-7.41，P=0.001、0.002，图4）。

图4 miR-762对PANC-1细胞凋亡的影响（流式细胞术）Fig.4 Effect of miR-762 on apoptosis of PANC-1 cells (flow cytometry)

2.5 miR-762对PANC-1细胞侵袭转移的影响

划痕实验结果显示，转染48 h后，空白对照组、阴性对照组、miR-762 mimics组、miR-762 inhibitors组细胞迁移距离分别为（1.04±0.27）μ m、（1.00±0.24）μ m、（1.79±0.16）μm、（0.34±0.10）μm。与阴性对照组比较，miR-762 mimics组细胞迁移距离显著延长，miR-762 inhibitors组细胞迁移距离显著缩短（t=-11.29、7.68，P=0.000、0.002）。Transwell侵袭实验结果显示，转染48 h后，空白对照组、阴性对照组、miR-762 mimics组、miR-762 inhibitors组穿膜细胞数分别为（196.40±25.13）个、（188.20±26.04）个、（279.40±20.31）个、（92.80±11.08）个。与阴性对照组比较，miR-762 mimics组穿膜细胞数显著增加，miR-762 inhibitors组穿膜细胞数显著减少（t=-4.91、6.67，P=0.008、0.003，图5）。

图5 miR-762对PANC-1细胞侵袭转移的影响Fig.5 Effect of miR-762 on invasion and migration of PANC-1 cells

2.6 miR-762对PANC-1细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）相关标志物的影响

Western blot结果显示，转染48 h后，与阴性对照组比较，miR-762 mimics组上皮细胞标志物E-cadherin表达量明显降低，间质表型细胞标志物N-cadherin、vimentin表达量明显增加（t=7.87、-6.11、-4.53，P=0.001、0.004、0.011）；而miR-762 inhibitors组上皮细胞标志物E-cadherin表达量明显增加，间质表型细胞标志物N-cadherin、vimentin表达量明显降低（t=4.13、5.31、6.78，P=0.014、0.006、0.002，图6）。

图6 Western blot检测EMT相关蛋白表达Fig.6 Expression of EMT-associated proteins detected by Western blot

3 讨 论

胰腺癌预后极差，与其早期易发生侵袭转移密切相关［7］。研究发现，多种miRNA表达失调在胰腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移方面发挥重要作用［8-10］。因此，寻找与胰腺癌发生、发展密切相关的miRNA具有积极意义。miR-762与肿瘤关系密切，Hou等［5］发现卵巢癌组织高表达miR-762，与患者预后呈负相关，还发现抑癌基因menin是其下游靶基因。Li等［6］也证实乳腺癌组织和细胞株高表达miR-762，可靶向下调IRF7基因表达。但miR-762在调控胰腺癌发生、发展中的作用尚不清楚。本研究结果表明，胰腺癌组织及4种胰腺癌细胞株中miR-762呈高表达，提示miR-762可能参与了胰腺癌的形成及进展。在此基础上，本研究采用基因干扰技术在胰腺癌PANC-1细胞中过表达和抑制表达miR-762，并采用CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验检测调节miR-762表达对PANC-1细胞增殖、凋亡及侵袭转移的影响，结果发现，上调miR-762表达能够显著增强PANC-1细胞的增殖及侵袭转移能力，并抑制其凋亡；相反，下调miR-762表达能够显著抑制PANC-1细胞的增殖及侵袭转移能力，并促进其凋亡。

EMT是肿瘤耐药、干细胞样特性形成及获得更高恶性程度的关键环节［11-14］。在此过程中，上皮标志物E-cadherin表达量降低，而间质标志物N-cadherin、vimentin表达量升高。本研究结果表明，过表达miR-762能够显著上调胰腺癌细胞N-cadherin、vimentin表达，下调E-cadherin表达；而抑制miR-762表达能够显著下调胰腺癌细胞N-cadherin、vimentin表达，上调E-cadherin表达，证实miR-762可能参与调控胰腺癌细胞EMT进程。

综上所述，miR-762在胰腺癌组织和细胞株中异常高表达，通过影响EMT进程促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移，提示miR-762有可能成为胰腺癌诊断和治疗的潜在靶点。然而，miR-762调控胰腺癌细胞生物学行为的具体靶点仍需深入研究。