利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF2基因的稳定敲除及其功能研究

龚美玲，张琳琳，郑翠侠

同济大学附属杨浦医院呼吸内科，上海200090

核转录因子E2相关因子2［nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2，NRF2］是一个亮氨酸拉链转录因子，与核转录因子E2（nuclear factor-erythroid derived 2，NF-E2）、核转录因子E2相关因子1（nuclear factor erythroid 2-related factor 1，NRF1）及核转录因子E2相关因子3（nuclear factor erythroid 2-related factor 3，NRF3）等同属Cap“n”Collar（CNC）家族［1-2］。NRF2是一个抵抗氧化应激的关键核转录因子［3］。在正常稳态环境下，NRF2与细胞质中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）结合，导致NRF2被降解。而在氧化应激环境中，KEAP1与NRF2解离，NRF2进入细胞核中与小Maf蛋白形成二聚体结构与抗氧化元件ARE结合，激活下游抗氧化基因、解毒基因及细胞代谢相关基因的表达［4］。NRF2已被证明与多种肿瘤发生、发展及耐药相关，如乳腺癌、结肠癌、皮肤肿瘤、膀胱癌及肺癌等［5-10］。

NRF2拥有7个高度保守的Neh（Nrf2-ECH homology）同源结构域，即Neh1～Neh7。其中Neh1位于近羧基端，主要包含一个碱性亮氨酸拉链bzip（basic leucine zipper）区，是一个DNA结合域，而且可以与小Maf蛋白形成二聚体促进与抗氧化元件ARE结合［11-13］；Neh2包含7个可受泛素化修饰的赖氨酸残基以及2个Keap1结合位点（ETGE和DLG），对NRF2的活性和稳定性的调节极为重要［14-15］；Neh3区域通过招募共激动剂染色质解螺旋酶DNA结合蛋白6（chromodomain helicase DNA binding protein 6，CHD6)，上调NRF2目标基因表达水平［16］；Neh4和Neh5区域协同招募CBP参与ARE调控下游靶基因［17］；Neh6结构域是富含丝氨酸的区域，其参与NRF2稳定性的负调节，而且与Keap1无关［18］；Neh7结构域研究较少，与视黄酸X受体α结合可抑制NRF2基因转录［19］。

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对NRF2基因进行敲除，敲除序列选择在CNCbzip区，bzip区主要通过与小分子肌腱纤维肉瘤（small masculoaponeurotic fibrosarcoma，sMaf）蛋白形成二聚体从而与下游抗氧化元件ARE结合，促进下游靶基因的转录。该结构域一旦被敲除，NRF2主要功能丧失，下游相关抗氧化基因、解毒酶基因等表达下降，从而使肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力下降。

1 材料和方法

1.1 材料

肺腺癌细胞株（A549）、人胚肾细胞株（HEK-293T）购自中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，pLenti CRISPR v2载体购自领恪（上海）生物科技有限公司，BbsI酶、BsmBI酶、T4DNA连接酶购自美国Thermo Fisher公司，质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Blasticidins购自美国Invitrogen公司，LipofectamineTM2000试剂、Ham's F-12K（Kaighm's）培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibco公司，实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）检测试剂购自宝生物工程（大连）有限公司，结晶紫购自美国Sigma公司，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒上海碧云天生物技术有限公司，Transwell板（24孔、孔径8.0 μm）购自美国Corning公司，寡核苷酸序列由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸序列合成

采用CRISPR在线设计工具（http://crispr.mit.edu/）根据评分系统，在NRF2基因的第5外显子设计2个sgRNA（sgRNA-F，sgRNA-R）。寡核苷酸序列见表1。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

1.2.2 质粒构建［20］

把2条sgRNA寡核苷酸单链退火连接，用BsmBI酶将pLenti CRISPR v2载体线性化，然后利用T4连接酶过夜将退火后的产物连接到线性化的载体上，转化至DH5α感受态细胞中。挑单克隆菌落并抽取质粒送至公司测序验证。

1.2.3 慢病毒质粒包装［21］

病毒包装是我们实验室比较成熟的一项技术。根据pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R质粒与慢病毒包装载体PSPAX2，PMD2.G之间的摩尔质量比，计算出各自需要的量，实现pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R质粒的共同转染至HEK-293T细胞，6 h后换成含血清的高糖DMEM培液，48 h后收集病毒上清液，与polybreen（聚凝胺，转染增强剂）（8 μg/mL）比例充分混合后加入A549细胞培养板中，72 h后弃去培液，加入含Blasticidins（20 μg/mL）的F-12K培养基，筛选7 d后，将剩余存活细胞铺至96孔板，保证每孔1个细胞，数天后开始挑取单克隆细胞，提取细胞DNA。然后在靶序列两端设计引物（表2），RTFQ-PCR扩增产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。

表2 靶序列扩增引物Tab.2 Target sequence amplification primers

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测

采用上海碧云天生物技术有限公司的细胞裂解液提取3株纯合敲除细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按每组20 μg等量上样，转膜条件为300 mA，2 h。剪膜。采用5%BSA封闭2 h后按1∶2 000温育NRF2一抗抗体（美国Abcam公司），HO-1一抗抗体（CST）。β-actin（CST）。4 ℃慢摇过夜，12～18 h后回收一抗，1×TBST洗3次，每次10 min，室温按1∶5 000温育二抗抗体2 h，回收二抗，1×TBST洗3次，每次10 min，最后显影。

1.2.5 RTFQ-PCR检测

TRIzol法提取3株纯合敲除细胞RNA，采用宝生物工程（大连）有限公司生产的反转录及RTFQ-PCR试剂盒，比较未敲除组与敲除组NRF2基因及下游靶基因的转录水平的表达。每个样本3个复孔，分别进行3次独立重复实验。

1.2.6 平板克隆形成实验［21］

胰酶将细胞消化下来后，使用细胞计数仪计数，计3次，每孔按1 000个细胞数量进行铺板，挑选一株敲除细胞（NRF2 sgRNA-2）与未敲除细胞（A549）进行对比，10%FBS的完全培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养10～14 d。镜下观察到大于50个细胞的克隆出现时，终止培养。弃去培养液，PBS洗3遍，加入甲醇固定15 min，PBS洗3遍。每孔加入1 mL结晶紫10 min，吸出后缓慢冲洗干净染色液，干燥后拍照；或在显微镜下，计数每孔大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率；克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.2.7 细胞划痕实验［21］

将A549细胞与NRF2 sgRNA-2敲除细胞铺至6孔板，6孔板在加入培养液之前先用Mark笔在板下划3～5条等距直线，待次日细胞数量达到95%时，取出6孔板，倒掉培液，选择10 μL的移液器吸嘴用直尺比着开始划痕，每个孔里可以多划几道伤痕，PBS洗3遍，加入无血清培养基进行培养，分别在0、24和48 h时在倒置显微镜下进行定点拍照即可。

1.2.8 细胞Transwell实验［21］

将200 μL无血清细胞悬液（含3×104个细胞）接种到上室，在下室加入含10%FBS的培液、37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h，取出小室，用棉签将上室细胞擦拭干净，预冷甲醇液固定10 min，弃掉甲醇PBS洗2遍，结晶紫染色20 min，缓慢冲洗干净染色液，干燥后显微镜下拍照即可。

1.2.9 CCK-8检测［22］

将处于对数生长期的细胞铺至96孔板，每孔铺5×103个细胞，每组细胞3个复孔，待细胞完全贴壁后，每100 μL培液中加入10 μL的CCK-8试剂，放置培养箱中温育3 h，酶标仪下检测吸光值（D）值，弃去CCK-8换入正常培养液继续培养养，以此类推，分别检测在24、48和72 h的D值即可。

2 结果

2.1 重组质粒测序结果

将sgRNA退火连接到载体pLenti CRISPR v2上，转化后挑单克隆抽质粒，然后送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序验证靶序列正确插入载体，黑色方框框住的序列即为靶序列（图1）。

2.2 NRF2纯合子敲除细胞株

将pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R两个质粒通过包装慢病毒的方式共同转染入A549细胞株中，有限稀释法挑选单克隆细胞株，提取DNA后PCR扩增目的片段，最后送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序验证敲除，根据测序结果挑选纯合子，本次实验挑选出了3株纯合敲除细胞，分别命名为NRF2 sgRNA-1、NRF2 sgRNA-2和NRF2 sgRNA-3。测序结果显示3种不同的编辑方式的确在靶序列部位部分敲除（图2）。

图1 靶序列插入质粒测序图Fig.1 Target sequences on plasmid sequencing maps

图2 3株纯合子敲除细胞株基因编辑方式Fig.2 Gene editing methods for 3 homozygous knockout cell lines

2.3 NRF2基因及其下游HO-1蛋白水平

3株纯合子敲除细胞进行NRF2蛋白表达验证，结果显示NRF2基因确被敲除。与A549细胞相比较，NRF2及其下游靶基因HO-1（血红素加氧酶-1）抗氧化酶的蛋白水平显著降低，进一步验证NRF2敲除成功（图3）。

图3 3株NRF2纯合敲除的A549细胞蛋白水平结果显示NRF2及其下游靶基因HO-1表达显著降低Fig.3 The results showed that the expressions of NRF2 and its downstream target gene HO-1 were significantly decreased in 3 NRF2 homozygous knockout A549 cells

2.4 NRF2及其下游靶基因mRNA表达水平

与A549细胞相比较，NRF2敲除后其自身及下游靶基因HMOX1、HO-1、GCLC、NQO1、FTH1 mRNA表达都明显下降，说明bzip区域的敲除确实可以阻断NRF2与ARE的结合，从而抑制下游靶基因的表达，统计方法采用未配对t检验（图4）。

2.5 NRF2敲除细胞系增殖能力

通过平板克隆形成实验，可以观察到与A549细胞相比较，NRF2敲除细胞增殖能力明显低于未敲除细胞，表明NRF2在肺癌发展中起重要作用（图5）。

2.6 NRF2敲除细胞系增殖能力

图4 NRF2敲除细胞株与A549细胞株之间NRF2下游靶基因表达的比较Fig.4 Comparison of NRF2 downstream target gene expression between NRF2 knockout cell line and A549 cell line

图5 A549与NRF2 sgRNA-2细胞平板克隆形成实验Fig.5 Comparison of the ability of A549 to differentiate into NRF2 sgRNA-2 cell plate clones

通过CCK-8实验方法检测活细胞数及增殖能力，可以观察到随着时间增长，NRF2敲除细胞的D值明显低于未敲除细胞，D值的大小与活细胞数成正比（图6）。

2.7 NRF2敲除细胞系迁移能力

通过细胞划痕实验可以观察到随着时间的延长，NRF2敲除细胞系伤痕愈合即迁移能力明显低于A549细胞，充分证明A549细胞NRF2基因敲除后会明显降低肿瘤细胞的迁移能力（图7）。

2.8 NRF2敲除细胞系侵袭能力

采用Transwell法比较细胞的侵袭能力，结果显示，NRF2敲除后A549细胞的侵袭能力较亲本A549细胞显著减低，表明NRF2基因敲除可以使A549肺癌细胞的侵袭能力下降（图8）。

图6 A549、NRF2 sgRNA-2细胞加入CCK-8试剂后0、24、48和72 h的D值折线图Fig.6 Line diagram of D values at 0,24,48 and 72 h after CCK-8 reagent was added to A549 and NRF2 sgRNA-2 cells

图7 A549与NRF2 sgRNA-2细胞株迁移能力的比较Fig.7 Comparison of migration ability between A549 and NRF2 sgRNA-2 cell lines

图8 A549与NRF2 sgRNA-2细胞之间侵袭能力的比较Fig.8 Comparison of invasive ability between A549 and NRF2 sgRNA-2 cells

3 讨 论

近年来，CRISPR/Cas9成为科研领域一项很热门的技术，具有设计简单、操作方便，成本低、效率高且可同时进行多位点编辑等优势。CRISPR/Cas9系统可以快速方便地在哺乳动物细胞系、动物模型中实现基因组编辑［23-25］。除此之外，该基因编辑技术在医学领域疾病治疗方面也有所进展［26-27］。此外，本次实验利用慢病毒表达载体，具有转染效率高、目的基因稳定表达等优点，可为后续其他功能研究带来方便。

NRF2基因已被证明在很多肿瘤中携带有突变或高表达状态，NRF2的表达和活性增强与肿瘤的发生、发展、耐药及预后等相关［28］。本实验选取的人A549肺癌细胞本身携带有KEAP1基因G333C突变，且NRF2基因高表达［29］。我们选择利用CRISPR/Cas9技术对NRF2基因实现稳定敲除。在NRF2基因7个Neh高度保守序列中，我们选择针对Neh1区域的CNC-bzip结构上下游设计一对sgRNA。Neh1区域包括CNC-bZIP区域，该区域是DNA结合和NRF2与sMaf蛋白结合形成二聚体所必需的区域［30］。故该结构被敲除后，NRF2与下游靶基因的抗氧化元件ARE结合能力显著降低，导致各类抗氧化基因、药物解毒相关基因等蛋白水平及mRNA表达也受到抑制。有研究报道，A549肺癌细胞NRF2基因敲除在体外移植瘤实验中单独表型即表现为增殖减慢，而且联合卡铂、顺铂等化疗药物能更明显抑制肿瘤的生长［20］。与我们体外功能研究结果相一致，克隆形成、CCK-8、细胞划痕、Transwell等实验也证明NRF2基因敲除后细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力都显著降低。

利用CRISPR/Cas9慢病毒系统获得高效永久NRF2基因敲除肺癌细胞系，且NRF2基因敲除后A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力都显著降低。