低压低氧大鼠脱适应期血脑屏障通透性和脑微血管密度的变化

罗 强,刘卫平,龙乾发,张胡金,柴 源,苗 宇,伊西才

(1西安市中心医院神经外科,西安 710003;2空军军医大学西京医院神经外科;*通讯作者,E-mail:Liuwp@fmmu.edu.cn)

高原脱适应反应的发病机制尚未完全清楚,也无有效的防治措施。中枢神经系统是人体对低氧刺激最敏感、耐受性最差的部位,高原低氧对其影响不言而喻。Fischer等[1]研究证实,缺氧可损伤血脑屏障(blood brain barrier,BBB),引起脑血管通透性增高,使细胞间的异常漏出增多而发生水肿。组织缺氧会刺激CD34+细胞代偿性增加并分化为内皮细胞而形成新生血管[2]。因此,脑微血管密度(microvessel density,MVD)的代偿性增加及BBB通透性增高与高原病的发生关系密切。而在脱离高原环境进入常氧环境后,脑MVD及BBB通透性会发生怎样的变化?本研究通过建立实验性低压低氧大鼠模型,探讨在脱适应期脑MVD和BBB通透性的改变及与返回常氧环境时间的关系,旨在为高原脱适应反应的发病机制及防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5-6周龄雄性SD大鼠72只,清洁级,由空军军医大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(军)2007-007,体质量150～200 g,随机分为低压低氧大鼠模型组与常氧环境对照组,根据返回常氧环境不同时间模型组又分为5个亚组,每组12只大鼠。

1.2 主要试剂和设备

伊文氏蓝(Evans blue,EB)及甲酰胺均购于美国Sigma公司,单克隆兔抗大鼠CD34抗体(BA0532)购自于武汉博士德生物有限公司,免疫组化试剂盒及DAB显色试剂购自北京中杉金桥公司。高原环境模拟舱为贵州风雷航空军械有限公司,紫外分光光度仪为德国Sartotius公司产品。

1.3 动物模型制备

模型组大鼠放入模拟海拔4 000 m的高原环境模拟舱,氧浓度为12.6%,温度25 ℃,光照周期12 h,自由饮食水,定时向高原环境模拟舱内添加水、鼠粮、更换垫料。在高原环境模拟仓饲养4周后将其移至常氧环境,分别在至常氧环境后1,3,7,14,30 d,分别检测每个亚组脑组织BBB通透性及CD34表达量。

1.4 伊文氏蓝(EB)示踪法测定血脑屏障通透性

伊文氏蓝(EB)标准曲线绘制:按照倍率稀释法建立EB的标准曲线,配置质量浓度10 mg/100 ml的原始EB溶液,以甲酰胺作为空白对照调零液,依次稀释形成质量浓度为10,5,2.5,1.25,0.625,0.312 5,0.156 3 μg/ml浓度梯度的标准溶液,60 ℃水浴孵育24 h，测定波长625 nm处EB的吸光度(OD)值，绘制EB标准曲线，计算线性回归方程。

脑组织EB含量的测定:使用EB作为检测BBB通透性的示踪剂,对照组及每个亚组内随机取6只大鼠,尾静脉注入2% EB(2 ml/kg)。在注入EB几分钟后,可见大鼠眼球结膜、唇、四肢等显示深蓝色,表示EB注射进入体循环。2 h后用250 ml预冷肝素生理盐水灌注心脏,直至流出液颜色清亮,迅速取大鼠脑组织,称重后机械性粉碎湿脑组织,按每100 mg湿脑组织加3 ml甲酰胺加盖避光,60 ℃水浴24 h，3 000 r/min离心20 min，检测样本上清液的OD625 nm值，根据线性回归方程计算出各样本中EB的浓度，求得脑组织EB的含量(μg/g湿脑组织)。

1.5 免疫组化法检测CD34的表达

到达取材时间后取每组剩余6只大鼠,10%水合氯醛麻醉后行左心室插管,依次用预冷肝素生理盐水、4%的多聚甲醛灌注后取脑,所有脑组织立即放入10%多聚甲醛溶液固定24 h,常规石蜡包埋,2 μm厚连续切片。免疫组化采用SP(streptavidin perosidase)法,切片常规梯度脱蜡至水,柠檬酸溶液中高温高压抗原修复100 s,3%H2O2溶液封闭20 min。山羊血清封闭1 h,滴加一抗,4 ℃孵育过夜，PBS冲洗,分别滴加生物素标记的山羊抗兔二抗,室温孵育30 min,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,室温孵育20 min,PBS冲洗,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,阴性对照用PBS代替一抗。光学显微镜下,血管内皮细胞核膜棕褐色为CD34+细胞,每组选10张切片,每张切片高倍镜下(×400)在皮质区随机取不重叠的5-10个视野进行CD34+细胞计数,染成棕褐色的有核细胞均视为阳性细胞,最后取高倍视野微血管数的平均值作为该组脑MVD值。

1.6 统计学分析

2 结果

低压低氧模型组大鼠脑组织EB含量较对照组明显增加,以返回常氧环境第1天最为显著(P<0.01),在脱离低压低氧环境后,脑组织EB含量随着返回常氧环境时间的延长而逐渐呈降低的趋势,与返回时间呈显著负相关(r=-0.898,P=0.038),而模型组大鼠在返回常氧环境30 d时脑组织EB含量仍然高于对照组水平(P<0.05,见图1,2),表明BBB通透性尚未完全恢复到正常水平。与BBB通透性的变化一致,低压低氧模型组大鼠脑MVD(CD34+细胞数)与对照组相比明显增多(P<0.01),在脱离低氧环境早期时最为明显,脑MVD的变化与返回常氧环境时间呈高度负相关(r=-0.883,P=0.016);模型组在返回常氧环境30 d时也高于对照组水平(P<0.05，见图1,2),表明脑MVD的改变仍处在脱适应期。

图1 低压低氧模型组大鼠返回常氧环境后CD34+细胞的表达变化 (×400)

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

脱适应症是人体脱离高原低氧进入常氧环境后的一种适应性反应,会伴随一系列的生理反应和临床表现,其主要症状有疲倦、乏力、嗜睡、胸闷、气短、头昏、腹胀、腹泻等[3-7]。近年来,高原地区与平原地区交流更加广泛,加之参加青海玉树等高原地区抗震救灾官兵返回平原后出现的脱适应反应,使得高原脱适应反应越来越受到医学界的关注[8]。

BBB是中枢神经系统与外周血循环之间物质交换的调节器,由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜构成的,对于维持神经系统内环境的相对稳定起到关键的作用,其通透性的改变是多种中枢神经系统病变中常见的、较早发生的变化[9,10]。有研究显示,高原低氧暴露对BBB及血管内皮细胞的损伤使其通透性增高,血管内渗出增多,脑组织含水量增加,表明高原脑水肿是一种血管源性水肿[11,12]。脑微血管是供给脑组织氧、营养必需物质及相应量血液的传送装置,已有研究表明机体在受到低氧、缺血、损伤等刺激时,作为一种保护性因素的脑MVD会代偿性增加,而CD34+细胞在过程中发挥着重要的作用,CD34+细胞是一类具有自我更新,多向分化及重建造血和免疫的内皮祖细胞,在促进血管新生、组织修复、创伤愈合等方面发挥着重要的作用[13]。在机体受到低氧、损伤等刺激时,CD34+细胞会代偿性增加。Gong等[14]报道,在CD34+细胞聚集的过程会伴随着血管内皮生长因子和血管生成素等促血管生成因子的分泌增加,血管内皮生长因子能够促进基质金属蛋白酶9的活化,抑制紧密连接蛋白的表达,从而增加BBB的通透性,加重脑水肿。由此可见在机体受到低氧、损伤等刺激时CD34+细胞的增多与BBB通透性及脑水肿密切相关[15]。

本次研究结果显示,低压低氧大鼠在重返平原后BBB通透性及脑MVD较对照组明显增加,随着返回时间的延长均呈降低的变化趋势。石自福等[8]曾报道,脱适应反应症状多出现返回平原后1周,大多症状在一个月内逐渐减退并消失,但有些持续时间较长甚至反复出现。Pichiule等[16]发现大鼠从高海拔缺氧环境返回常氧环境后短时间内血细胞数量及脑MVD依然较高,保持了较强的输氧能力,使组织处于高氧状态,在返回常氧环境后,脑微血管内皮细胞的凋亡增加以降低大脑MVD。本研究结果证实,BBB通透性及脑MVD的改变以返回常氧环境早期时最为显著,与高原脱适应反应发生有时间上的一致性。因此,高原脱适应反应的发生可能与低压低氧引起的BBB通透性及脑MVD的改变有关。BBB通透性增加,屏障功能减弱,可促使脑水肿的形成,也可使一些代谢有害物质大量进入脑组织,破坏了神经系统内环境的相对稳定;脑MVD的增加使得脑组织处于一种相对高氧的状态,出现“醉氧”的一些症状。在返回常氧环境30 d时,BBB通透性及脑MVD仍然高于对照组,表明高原脱适应是一个相对漫长的过程,要完全脱适应需要更长的时间。

本次研究从神经系统BBB通透性及脑MVD在脱适应期的改变进行分析,为预防和治疗脱高原适应反应及药物研发提供了理论基础。然而,高原脱适应反应是神经、血液、循环、呼吸、内分泌等多个系统共同参与的全身性疾病,要完全阐明脱适应反应的发病机制并制定有效的防治措施,需要进一步深入研究。