紫草素通过上调RIP1、RIP3蛋白诱导下咽癌细胞发生坏死性凋亡

崔忆旋,赵 报,李佳会,柳申成,孙 哲,吴 俊,丁晓娇,张双双,朱晨露,王楠楠,周兰柱,王文忠

(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉科,蚌埠 233000;*通讯作者,E-mail:lanzhu-07@163.com;#共同通讯作者,E-mail:13955259093@163.com)

头颈部肿瘤在人类肿瘤中较常见,下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)作为一种少见的恶性肿瘤,约占头颈部恶性肿瘤的3%-5%[1],其病理类型以鳞状细胞癌为主,腺样细胞癌少见。下咽癌生物学特性恶劣,发生部位隐蔽难察觉,且极易发生颈部淋巴结转移[2,3],预后差,生存率低。对于下咽癌的治疗,目前,同步放化疗与靶向药物治疗已经比较普遍,既能控制病情,同时也能保留咽喉部功能。坏死性凋亡(necroptosis)为一种程序性调控的细胞坏死[4],主要调控分子为受体相互作用蛋白1(RIP1)和受体相互作用蛋白3(RIP3),通过其级联反应进行相调控。近年来,由于化疗药物的大量使用,肿瘤细胞的耐药性在逐渐提高,其主要表现为对药物促凋亡的敏感性降低。而坏死性凋亡可不通过凋亡通路发挥药效,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。紫草素(shikonin)是从紫草中提取的一种萘醌类物质[5]。已有研究表明,紫草素能够诱导食管癌[6]、胶质瘤[7]、肝癌[5]等多种肿瘤细胞发生坏死性凋亡,该作用的好处是可有效规避在化疗过程中的耐药问题[8]。但是紫草素对下咽癌细胞的作用尚未进行探讨,本实验主要探讨紫草素对下咽癌细胞(Fadu)的死亡形式的影响及其可能机制,为下咽癌的临床治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人下咽癌细胞Fadu购自美国ATCC公司,培养于蚌埠医学院药学院生化实验室。DMEM培养基、胰蛋白酶(含EDTA)购自公司美国Hyclone公司,胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT试剂、双染细胞凋亡检测试剂盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天公司,Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3蛋白抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

人下咽癌细胞Fadu培养于含15 %胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中,于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.3 MTT实验检测细胞增殖

取对数期生长状态良好的Fadu细胞接种入96孔板,调整每孔培养液为100 μl,细胞数为1×105。待细胞贴壁后加入浓度分别为0,2,4,6,8,10 μmol/L的紫草素,于37 ℃、5% CO2培养至24,48,72 h,每孔加入15 μl MTT溶液,MTT浓度为5 g/L,继续培养4 h,小心吸去培养液,每孔加入150 μl DMSO,继续培养30 min,在490 nm波长处用检测吸光度值(OD490)。计算细胞存活率:细胞存活率(%)=实验组OD490/对照组OD490×100%。取平均值绘制药物剂量效应曲线,计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

1.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡

选取对数期生长状态良好的Fadu细胞,以每孔35×104个细胞接种于6孔板,待次日贴壁后加入浓度分别为0 μmol/L(空白孔)、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L的紫草素后,5% CO2培养24 h,用不含EDTA的胰酶消化细胞,其中空白孔分为4份,分别空白对照组、PI组、Annexin Ⅴ-FITC组以及对照组。600g离心5 min,PBS清洗2次,加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液混匀,加入1.5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液轻轻混匀,避光冰浴15 min;加入1.5 μl PI染色液,避光冰浴5 min,加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液混匀。用流式细胞仪测出细胞凋亡率,此实验重复3次。

1.5 Western blot法检测蛋白表达水平

将对数期生长状态良好的Fadu细胞以不同浓度的紫草素处理,浓度分别为0 μmol/L(对照组),2,4,6 μmol/L。48 h将细胞消化至离心管,PBS洗涤两遍后加入70 μmol含有PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,放入4 ℃冰箱过夜,次日离心30 min(12 000 r/min,30 min),取上清液。BCA法测出蛋白浓度,并计算出每组样本所需上样量。将蛋白总量相同的样本加入到蛋白凝胶内,90 V恒压待溴酚蓝到达分离胶的底部后终止。80 V恒压将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。室温摇床下用5%脱脂奶粉封闭2 h,使用TPBS洗涤5 min,重复3次。按1∶1 000的比例稀释β-actin、Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3一抗,摇床摇晃1 h,4 ℃孵过夜。用HRP标记的山羊抗兔(二抗)孵育2 h,ECL发光试剂盒显影。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对实验结果进行分析,实验数据均以均数±标准差表示,各组间差异采用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对Fadu细胞的增殖抑制作用

MTT结果显示,随紫草素浓度(0,2,4,6,8,10 μmol/L)的增加Fadu细胞存活率降低,且随时间的增加(24,48,72 h),Fadu细胞存活率逐渐降低,表明紫草素对Fadu细胞的作用具有浓度依赖性和时间依赖性(见图1)。作用24,48,72 h的IC50值分别为6.012,4.120,3.939 μmol/L,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

2.2 紫草素对Fadu细胞凋亡的影响

Annexin Ⅴ-FITC/PI双染结果显示,紫草素浓度为0(对照组),2,4,6 μmol/L时,细胞的凋亡率分别为13.75%±0.7%,29.7%±0.6%,42.1%±0.3%,53.1%±0.8%。随着紫草素浓度的增加,细胞的凋亡率在增加,不同浓度紫草素组凋亡率与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05,见图2)。由此可知,紫草素有诱导Fadu细胞凋亡作用。

2.3 紫草素对Fadu细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3表达的影响

检测结果表明,紫草素可下调凋亡抑制蛋白Bclκ2的表达和上调凋亡诱导蛋白Bax的表达进而诱导Fadu细胞凋亡,与此同时,上调坏死性凋亡的关键蛋白RIP1、RIP3诱导Fadu细胞发生坏死(P<0.05,见图3)。

紫草素浓度4,6,8,10 μmol/L时3个时间点两两比较,*P<0.05

图2 不同浓度紫草素对Fadu细胞凋亡的影响

3 讨论

近年来随着化疗药物的大量使用,肿瘤细胞耐药性增强,临床急需一种副作用小且抗癌作用强的药物。相关研究表明,紫草素具有保肝、降血糖、抑菌、抗病毒、抗炎、镇静、免疫调节、抗肿瘤及促进伤口愈合[9,10]等作用。

本实验的目的是探究紫草素对下咽癌细胞(Fadu)的增殖抑制和死亡形式的影响,由MTT实验可看出,紫草素可随时间和剂量抑制Fadu细胞的增殖。细胞凋亡的重要调控因子Bcl-2家族蛋白,包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl1、Bcl-2XL等。凋亡抑制蛋白具有保持线粒体膜完整性的功能,而凋亡诱导蛋白能够促使凋亡因子如细胞色素C、细胞凋亡诱导因子、第二线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂等的释放,最终通过激活caspase激酶而导致细胞凋亡。本实验采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测紫草素对Fadu细胞凋亡的影响,结果发现,紫草素能够显著诱导Fadu细胞发生凋亡,凋亡机制为下调凋亡抑制蛋白Bcl-2和上调凋亡诱导蛋白Bax的表达。坏死(necrosis)通常被视为意外和不受管制的细胞事件。然而,越来越多的证据表明,细胞凋亡等坏死可以通过调节机制来实施。Hitomi等[11]描述了一个广泛的基因网络,它介导一种称为坏死性凋亡(necroptosis)的程序性坏死形式,其通过多种因子调节,并且主要取决于RIP1的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。RIP1通过激酶依赖性和非依赖性功能调节细胞死亡和炎症[12-14]。RIP1、RIP3最后通过磷酸化[15-17]的方式形成复合体(necrosome)[18],诱导细胞的坏死性凋亡。而本研究Western blot结果表明紫草素能够上调坏死标志蛋白RIP1、RIP3蛋白的表达,表明紫草素可以诱导Fadu细胞发生坏死。

本实验表明不同浓度紫草素对Fadu细胞有增殖抑制及诱导其凋亡和坏死的作用,规避了常规化疗药物会产生耐药性的弊端,为下咽癌术前及术后化疗提供了新思路,但详细机制尚未得到进一步验证,有待于后续试验者证明。