复方ANBP启动修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad对小鼠创面愈合的影响

陈丽 周忠志，2 刘沐琳 陈港军 吉琳 杨乐 岳育民 邢琴

(湖南中医药大学 1医学院，湖南 长沙 410208；2第一附属医院)

严重创伤是危害人类健康的重要因素之一〔1～4〕。创伤愈合的以往研究大多与经典的转化生长因子(TGF)-β/Sma和Mad同系物(Smad)通路相关〔5，6〕。有研究证实，Ski基因是TGF-β/Smad信号通路的核内负调控因子，可双向调控TGF-β/Smad依赖和非依赖信号通路〔7，8〕。复方ANBP是仙鹤草(A)、藕节(N)、乳香(B)和蒲黄(P) 治疗创伤的经验方，用于创伤早期的治疗，具有止血消炎、活血生肌的功效〔9〕。复方ANBP是临床治疗创面的经验药方，有一定的临床基础，且有广泛的促进创面愈合实验研究。前期研究发现，复方ANBP双向调节TGF-β/Smad信号通路达到促进创面愈合抑制瘢痕的效果〔9，10〕，但能否启动修复基因Ski双向调节TGF-β/Smad通路促进创面愈合的机制研究尚缺乏〔11，12〕。本实验通过建立小鼠背部全层皮肤缺损模型，观察创面愈合情况及TGF-β1、Smad2/3、Ski的表达变化，进一步探讨复方ANBP促进创面愈合的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康无特定病原体(SPF)级C57BL/6雌性小鼠48只，7周龄，体质量10～20 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.2实验药物、试剂 复方ANBP由湖南中医药大学第一附属医院购买仙鹤草、藕节、乳香和蒲黄并制备〔13〕，试验全过程使用同种药物。抗Ski抗体(批号：ab131134)、抗Smad2/3抗体(批号：ab217553)、抗TGF-β1抗体(批号：ab92486)、羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G H&L(批号：ab6721)均购自Abcam公司。

1.3分组及建立动物模型 小鼠适应性喂养3 d后按随机数字表法分为ANBP组、空白对照组各24只。两组均分别随机分为4个亚组各6只，造模时腹腔注射10%水合氯醛(5.5 ml/kg)麻醉，将实验器械均消毒完毕后开始脱毛、备皮、消毒，用直径1 cm的全层打孔器在小鼠背部制成全层皮肤缺损模型。造模后，空白对照组不做处理，ANBP组的创面上立即均匀覆盖上一层中药复方ANBP粉末。

1.4标本采集 两组分别于造模后6 h、3 d、7 d、14 d用10%水合氯醛麻醉，对创面拍照记录。取相同部位以创面为中心、深至骨组织的大小为2 cm×2 cm标本，于4%多聚甲醛的瓶中固定，常温保存。

1.5免疫组化检测 ①脱蜡和水化：二甲苯10 min×3次→无水乙醇浸泡3 min×3次→95%乙醇中浸泡3 min×2次→75%乙醇中浸泡3 min×2次→蒸馏水冲洗1 min→置于磷酸盐缓冲液(PBS)中。②抗原修复：滴pH6.0枸橼酸缓冲液于切片上，置微波炉加热至沸腾，间隔5～10 min×2次，室温冷却。③阻断内源性过氧化物酶：加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min；PBS冲洗3 min×3次。④滴加一抗：滴加100 μl一抗，小鼠单克隆抗体Ski(稀释浓度1∶100)、兔多克隆抗体Smad2/3(稀释浓度1∶50)、兔多克隆抗体TGF-β1(稀释浓度1∶100)，37℃孵育60 min：PBS冲洗3 min×3次。⑤滴加反应增强液：滴加100 μl反应增强液，室温孵育20 min；PBS冲洗3 min×3次。⑥滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物：滴加100 μl增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育20 min；PBS冲洗3 min×3次。⑦显色：加入适量二氨基联苯胺(DAB)显色液，室温孵育6 min。⑧复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育20 s；分化、冲洗返蓝。⑨脱水、透明、封片。

1.6平均光密度值计算 显微镜下观察皮肤组织中的Ski、Smad2/3、TGF-β1蛋白在各组不同时间点的表达，显示棕黄色颗粒为阳性结果。每张切片随机选择5个高倍镜下视野，采用MOTIC6.0图像分析软件分析阳性染色的光密度值，取平均值。

1.7统计学处理 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、Mann-WhitneyU检验。

2 结 果

2.1复方ANBP对TGF-β/Smad信号通路的双向调节 TGF-β1阳性表达部位在成纤维细胞胞质及细胞外基质中，棕黄色颗粒为阳性表达；Smad2/3蛋白表达于成纤维细胞胞质和胞核中，棕黄色颗粒为阳性表达。造模后6 h，空白对照组可见少量成纤维细胞，胶原稀疏，少量阳性颗粒，着色浅且面积小，表达量少；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量增多，胶原增多，阳性颗粒增多，表达量增加。造模后3 d，空白对照组成纤维细胞数量增多，胶原增多，阳性颗粒增多，表达量增加；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量明显增多，胶原更致密，阳性颗粒增加明显，表达量明显增多。造模后7 d，空白对照组成纤维细胞数量明显增多，胶原更致密，阳性颗粒增加明显，表达量明显增多；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量减少，胶原疏松，阳性颗粒明显减少，表达量降低。造模后14 d，空白对照组成纤维细胞数量减少，胶原含量降低，阳性颗粒减少，表达量降低；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量明显减少，胶原更疏松，阳性颗粒明显减少，表达量明显降低，见图1。

图1 造模后各时间点两组背部创面组织TGF-β1及Smad2/3的表达(苏木素染色，×400)

2.2复方ANBP对Ski蛋白表达的影响 Ski阳性表达部位在成纤维细胞胞核中，棕黄色颗粒为阳性表达。造模后6 h，空白对照组可见成纤维细胞，较多阳性颗粒，着色较深且面积较大，表达量较多；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量较少，胶原较少，阳性颗粒少，表达量减少。造模后3 d，空白对照组成纤维细胞数量明显增多，胶原更致密，阳性颗粒增加明显，表达量明显增多；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞、胶原增多，阳性颗粒增多，表达量增加。造模后7 d，空白对照组成纤维细胞数量减少，胶原疏松，阳性颗粒明显减少，表达量降低；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量显著增多，胶原致密，阳性颗粒明显增加，表达量增加。造模后14 d，空白对照组成纤维细胞、胶原减少，阳性颗粒减少，表达量降低；与空白对照组相比，ANBP组成纤维细胞数量继续增加，胶原更致密，阳性颗粒持续增多，表达量明显增加，见图2。

图2 造模后各时间点创面组织Ski的表达(苏木素染色，×400)

2.3TGF-β1、Smad2/3、Ski在造模后6 h、3 d、7 d、14 d平均光密度值比较 TGF-β1和Smad2/3蛋白免疫组化结果均显示，空白对照组从造模后6 h至7 d表达量逐渐增高，造模后7 d达到峰值，造模后14 d虽有所降低，但仍较高；而ANBP组从6 h至3 d表达量逐渐增高，造模后3 d达到峰值，造模后7～14 d逐渐降低；造模后3 d，ANBP组的表达量明显高于空白对照组(P<0.05)，造模后7～14 d，ANBP组的表达量明显低于空白对照组(P<0.05)。空白对照组从造模后6 h至3 d Ski表达量逐渐增高，造模后3 d达到峰值，造模后7～14 d逐渐降低；而ANBP组从6 h至14 d表达量逐渐增高，造模后14 d达到峰值；造模后6 h至3 d，ANBP组Ski的表达量均低于空白对照组(P<0.05)，造模后7～14 d，ANBP组Ski表达量明显高于空白对照组(P<0.05)。见表1。

表1 TGF-β1、Smad2/3、Ski在两组造模后各时间点平均光密度值

与空白对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

创面修复的过程是一个多因素、多因子参与的复杂过程〔13～15〕。TGF-β/Smad通路与创伤修复相关，TGF-β和Smads蛋白分别是成纤维细胞的趋化因子和下游信号的关键调节蛋白，该通路可以直接或间接作用于炎症及修复细胞，促进创面愈合〔16，17〕。研究证实，复方ANBP是通过双向调节兔耳增生性瘢痕模型中TGF-β/Smad通路减轻炎症、促进肉芽形成，加速再表皮化达到促愈抑瘢疗效〔10〕。本研究结果说明ANBP在创伤早期促进真皮层TGF-β1和Smad2/3蛋白的表达，在造模后期明显降低其表达，可双向调节小鼠背部全层皮肤缺损模型TGF-β/Smad信号通路。

有研究证实，Ski是创伤修复的关键基因，同时是TGF-β/Smad信号通路的核内负调控因子，可双向调控TGF-β/Smad依赖和非依赖信号通路〔18～20〕。说明复方ANBP在创伤早期通过启动创伤关键修复基因Ski，双向调节真皮层TGF-β1和Smad2/3蛋白的表达，达到减轻创伤早期损伤和炎症反应，加快肉芽组织增生和再表皮化速度，加速创伤愈合的进程，提高创伤愈合质量，但复方ANBP对全层皮肤缺损小鼠愈合的分子机制仍有待深入研究。