响应面法对狐臭柴鲜叶果胶提取条件的优化

2019-12-10陈鸿申谢国芳张明生幸菲菲

中南林业科技大学学报 2019年12期

陈鸿申，谢国芳，张明生，王倩，幸菲菲

（贵州大学 a.生命科学学院国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心；b.山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州贵阳 550025）

狐臭柴Premna puberulaPamp.又名神仙豆腐柴、斑鸠占、臭树、水白腊等，隶属马鞭草科豆腐柴属的多年生直立或攀援灌木，主要生长于我国贵州、四川、云南、湖北、湖南、甘肃及陕西南部等地海拔在700～1 800 m 的山坡路边丛林中[1]。其根、茎、叶中含有多种药用成分[2-3]，具有清热解毒、消肿止血等功效，有治疗毒蛇咬伤、无名肿毒、创伤出血的作用[4]。狐臭柴叶片中含有蛋白质、氨基酸、可溶性糖、维生素、纤维素、过氧化物酶及丰富的果胶[5-6]，其果胶由α-半乳糖单体聚合而成，具有良好的凝胶、增稠、稳定等性能，被广泛应用于食品、化工、医药、纺织等行业[7]。我国是果胶需求大国，每年消耗果胶约1 500 t 以上，其中80%需进口[8]。据报道，豆腐柴属植物叶片中果胶含量达30%～40%[9]，目前虽有不少关于这类植物果胶提取的研究文献[10-16]，但提取原料均为干叶，其工艺需将鲜叶烘干粉碎后过筛处理，导致其生产成本增加，操作较为耗时、繁琐。因此，本研究以狐臭柴鲜叶为原料，在单因素实验基础上采用响应面法优化其果胶提取条件，以期为高效利用狐臭柴叶片果胶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料：狐臭柴野生资源来自贵州省务川仡佬族苗族自治县，经贵州大学熊源新教授鉴定，已在贵州大学实验基地人工种植多年。

生化试剂：D-半乳糖醛酸标品（上海源叶生物科技有限公司，纯度＞97%），咔唑（上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%），无水乙醇（天津市优谱化学试剂有限公司，分析纯），浓硫酸（南京盛庆和化工有限公司，分析纯），柠檬酸（天津市优谱化学试剂有限公司，分析纯）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

于生长旺季（8月份）采集贵州大学实验基地的狐臭柴叶片，于-20 ℃条件下杀青1 h（低温杀青有利于活性成分的保留），洗净、晾干表面水分后碎备用。

果胶的酸解与提取参照Pinheiro E S 等[17]的方法并适当改进。

1）酸解：称取备用的狐臭柴鲜叶15.0 g（m）于料理机中，加入150 mL 柠檬酸溶液（6.0%）后电动搅拌1～2 min，浆液平均倒入3 只烧杯中，按试验设定水浴温度进行浸提。

2）抽滤：趁热用真空泵将酸解液以100 目筛子抽滤。

3）沉淀：抽滤液浓缩后以冷冻的1.2 倍体积无水乙醇（较低温度的乙醇有利于沉淀生成）沉淀，于4 ℃冰箱中静置1 h 使果胶沉淀。

4）过滤、烘干及测定：过滤收集沉淀的果胶并以无水乙醇清洗干净，40 ℃烘箱中烘干得到果胶粗品，用研钵磨细后称量。

1.2.2 果胶提取的单因素实验

设置不同梯度的液料比（酸解液mL ∶鲜叶g =5:1、6:1、8:1、10:1、12:1）、柠檬酸含量%（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0）、提取温度（55、65、75、85、95 ℃）和提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），以果胶提取率为评价指标，考查液料比、柠檬酸含量、提取温度及提取时间对果胶提取的影响。

1.2.3 果胶提取条件优化实验

在单因素实验基础上，运用Design-Expert 8.0.6软件程序根据Box-Behnken 实验设计原理，设计4 因素3 水平，以液料比(A)、柠檬酸含量(B)、提取温度(C)及提取时间(D)为影响因素，果胶提取率(Y)为响应值，对提取条件进行优化（表1）。

表1 Box-Behnken 试验因素与水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.4 分析检测

目前，医院对水电气能耗的统计还停留在传统方式上，表计不全，科室能源消耗不明，楼宇能耗信息不清楚，给管理者制定决策带来一定难度。建设能耗监控智能平台刻不容缓。能耗监控平台基于智能化表计，互联网，以及操作平台，表计将各个用能单元准确计量，通过统一的协议传输到服务器，管理者通过操作界面获取能耗相关信息。能耗监控平台可提供楼宇能耗信息，科室能耗信息及对比，并能进行横向和纵向对比，管理者可通过访问服务器的方式随时随地查看医院能耗信息。建设能耗监控平台后，医院的能耗信息可全方位的展现在管理者面前，对科室精细化管理，节能措施的制定提供了真实可靠的参考依据。

采用咔唑-浓硫酸法[]18]测定果胶含量，其原理是果胶经水解生成半乳糖醛酸，通常是在浓硫酸条件下与咔唑作用显色并在紫外光照射下产生特征吸收。

半乳糖醛酸标准曲线绘制：精密称取半乳糖醛酸标品0.100 3 g 于100 mL 容量瓶中（浓度为 1 000 mg/L），以1 000 mg/L的标准储备液作为母液。取6 只试管编号，按表1依次加入各试剂，再依次加入0.2 mL0.15%咔唑乙醇溶液，观察到有白色絮状沉淀生成，不断摇匀。再依次加入6 mL 浓硫酸，不断摇动试管，再于85 ℃水浴中加热30 min，取出冷却摇匀（表2）。除空白外，不同浓度标准液呈现不同程度的显色反应（图1a）。于波长530 nm 处测定吸光度，以吸光度值(y)为纵坐标，半乳糖醛酸质量浓度(x)为横坐标，绘制半乳糖醛酸标准曲线（图1b）。

表2 半乳糖醛酸标准溶液配制Table2 Preparation of standard galacturonic acid solution

图1 半乳糖醛酸标准曲线Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

半乳糖醛酸含量测定：准确称取狐臭柴果胶样品50 mg，配制成0.1%的溶液，精确量取1.0 mL待测液，按照半乳糖醛酸标准曲线绘制实验步骤测定其吸光度值，并以半乳糖醛酸标准曲线回归方程计算其含量。计算公式如下：

式（1）中：W为半乳糖醛酸含量（%）；C为提取液中半乳糖醛酸质量浓度（g/mL）；V为提取液体积（mL）；M1为狐臭柴果胶质量（g）。

1.2.5 验证性实验

在响应面优化条件下，进行验证性试验，与理论预测值进行比较，以验证优化结果。

1.2.6 果胶含量的计算

Y=（CVW/M2）×100%。式中：C=X×稀释倍数×106；C为提取液中D-半乳糖醛酸质量浓度（g/mL）；V为提取液体积（mL）；W为半乳糖醛酸含量（%）；M2为狐臭柴鲜叶质量（g）；X为样品中半乳糖醛酸质量浓度（μg/mL）。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件对狐臭柴鲜叶果胶提取率的影响

2.1.1 柠檬酸含量的影响

在柠檬酸含量为1.0%～8.0%（pH 值4.46～ 1.57）范围内，果胶提取率随柠檬酸含量的增加逐渐上升而后趋于平衡；柠檬酸含量为6.0%时果胶提取率达最高（20.16%）；当柠檬酸含量＞6.0%（pH 值1.69）时，果胶提取率呈下降趋势（图2）。上述结果可能是随着柠檬酸含量的增加，解离出的H+趋于饱和，进而影响其化学活性所致。因此，最适柠檬酸含量为6.0%。

图2 不同柠檬酸含量对果胶提取率的影响Fig.2 Effects of different citric acid contents for pectin extraction rate

2.1.2 料液比的影响

液料比在5:1～10:1(mL:g)范围内，果胶提取率呈线性上升；当液料比＞10:1(mL:g)之后，提取率趋于平衡（图3）。这是因为液料比较小时，溶液的黏度较大，分子扩散速度低，提取率小，也可能是因为叶片中果胶含量与柠檬酸酸解程度相当，反应趋于平衡，提取率不再变化所致。因此，最适液料比为10:1(mL:g)。

图3 不同液料比对果胶提取率的影响Fig.3 Effect of different ratio of liquid to material for pectin extraction rate

2.1.3 提取温度的影响

提取温度在55～85 ℃范围内，果胶提取率随温度升高而增大，这与分子热运动加剧和柠檬酸的解离程度增强有关；提取温度为85 ℃时，果胶提取率达最大（20.24%）；当提取温度＞85 ℃后，提取率趋于下降，这可能是随着温度的升高，破坏了果胶的结构，致使其降解导致的。因此，最适提取温度为85 ℃（图4）。

图4 不同提取温度对果胶提取率的影响Fig.4 Effect of different extraction temperature for pectin extraction rate

2.1.4 提取时间的影响

提取时间在0.5～2.0 h 范围时，提取率随时间的延长呈线性增加；提取时间为2.0 h 时，果胶提取率最大（19.85%）；当提取时间＞2.0 h 时，果胶提取率降低，这可能是半乳糖醛酸的结构发生变化导致降解造成的。因此，最适提取时间为2.0 h （图5）。

图5 提取时间对果胶提取率的影响Fig.5 Effect of different extraction time on pectin extraction rate

2.2 狐臭柴鲜叶果胶提取条件响应面法优化结果

以液料比(A)、柠檬酸含量(B)、提取温度(C)及提取时间(D)为影响因素，以果胶提取率(Y)为响应值，对提取条件进行优化。Box-Behnken 响应面实验结果见表3，方差分析结果见表4。利用Design-Expert 8.0.6 对表3结果进行二次多元回归拟合，得到液料比(A)、柠檬酸含量(B)、提取温度(C)以及提取时间(D)与响应值果胶提取率(Y)的关系，其多元二次回归方程为：Y=22.91+0.26A+ 0.50B+0.77C+0.47D+0.075AB+0.45AC-0.21AD-0.13BC-0.27BD+0.22CD-0.76A2-0.54B2-0.40C2-2.53D2。

表3 Box-Behnken 响应面试验设计结果Table3 The results of Box-Behnken response surface design

由表4可知，该方程模型极显著（P＜ 0.000 1 ＜0.01），模型失拟项P=0.728 3 ＞0.05，说明响应面实验结果与数学模型拟合良好，实验误差小，因此，可用该数学模型对实验结果进行统计分析。其中，AB交互作用极显著（P＜ 0.01），二次项B2因素显著（P＜0.05），其余均不显著，表明各因素之间的交互作用不是简单的线性关系，其对果胶提取率的影响由大到小依次为提取时间和提取温度不显著且＞柠檬酸含量＞液料比。

表4 回归方程方差分析†Table4 Variance analysis of regression equation

2.3 单因素交互作用

对各因素之间的交互作用进行响应面分析，以考查各因素之间相互关系对果胶提取率的影响，得到响应面曲线图和等高线图（图6）。从图6可以看出，柠檬酸含量在低水平时，加大液料比能提高果胶的提取率；柠檬酸含量在高水平时，适当减少液料比能浸提出较多的果胶，其曲面较为平缓。同理（图6B），在较低提取温度范围内，加大液料比能提高提取率；提取温度较高时，减少液料比同样能浸提出较多的果胶，其曲面较为平缓。从图6C 可以看到，在一定范围内可通过升高或降低提取温度、且增加或降低柠檬酸浓度来提高果胶提取率，其曲面较为平缓。图6D 显示，液料比和提取时间两个因素交互关系较强，其响应曲面较陡，提取时间为1.5～2.0 h 及液料比为8:1～12:1（mL:g）时，提取率较高；液料比和提取时间过高或过低均会导致提取率下降，表明液料比和提取时间均有其适宜的水平范围。图6E、6F 反映提取时间和柠檬酸含量两个因素、提取时间和提取温度两个因素均有较强的交互关系，两因素之间的交互作用与提取率呈抛物线关系，其曲面较陡；在一定水平范围内，随着柠檬酸含量升高且提取时间延长、提取温度升高且提取时间延长，提取率逐渐增大，达最大值后，继续延长提取时间、增加柠檬酸含量和提高提取温度，果胶提取率便开始下降。

2.4 模型验证

经Design-Expert 8.0.6 软件分析，得到最佳果胶提取条件为液料比12:1(mL:g)、柠檬酸含量6.83%、提取温度85 ℃以及提取时间1.99 h。为验证模型的准确性和有效性，且为了便于实际操作，将提取时间设置为2.0 h 进行3 次平行实验提取狐臭柴鲜叶果胶，实测提取率为23.32%，与理论值24.12% 相接近，实测值为理论值的96.7%，说明该模型用于优化果胶提取条件是可行的。

2.5 狐臭柴干叶和鲜叶提取的果胶对神仙豆腐形成品质的影响

分别用狐臭柴干叶和鲜叶提取的果胶制作神仙豆腐，通过对神仙豆腐形成品质的比较，考察干、鲜叶果胶对神仙豆腐形成品质的影响（图7）。从图7A、7B 可看出，干叶和鲜叶提取的果胶色泽不同，其中，干叶提取的果胶呈淡棕色（图7A），鲜叶提取的果胶呈浅黄绿色，且较为鲜嫩（图7B）。此外，分别用狐臭柴干叶和鲜叶提取的果胶制作神仙豆腐，其形成品质具有明显差异（图7C、7D）。干叶果胶制作的神仙豆腐粘稠、不规则，呈黄绿色图7C），鲜叶果胶制作的神仙豆腐外观规则，呈翠绿色（图7D）。这有可能是干叶中叶绿素色素经干燥处理被分解，而鲜叶中叶绿素色素，尤其是叶绿素b 未被完全分解所致。

3 结论与讨论

图6 液料比，柠檬酸含量、提取温度及提取时间交互作用对果胶提取率的响应面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between ratio of liquid to material,citric acid contents,extraction temperature and time on pectin extraction rate

果胶提取方法有酸法、微波法及草酸铵提取法等[19]，曾有学者[20]用草酸铵-超声辅助提取豆腐柴叶片果胶，提取率达63.79%。但接触草酸铵会刺激皮肤，过度暴露将导致肾结石和肾损伤[23]。酸法是用稀酸将果胶水解为可溶性醛酸，再用乙醇将其沉析出来[21]，其提取方法成熟，操作简单，成本低。其中，柠檬酸因其具有3 个解离常数不同的羧基而表现出较强酸性和缓冲能力，常用作饮品、点心等食品的调味剂[10]。因此，柠檬酸作为酸解质用于提取果胶具有一定优势。本研究的响应面优化结果显示，果胶提取率方程模拟效果较为合理（模型失拟项P=0.728 3 ＞0.05）。单因素实验与响应面优化结果较为吻合，在一定的提取温度和提取时间范围内，通过增加柠檬酸含量和降低液料比可使果胶的提取率增加。本研究模型的预测值与理论值较为吻合（实测值为理论值的96.7%），说明响应面法优化结果具有一定的实际参考价值，且本方法提取的果胶呈鲜嫩淡黄色，其制作的神仙豆腐色泽翠绿、外观规则，可为狐臭柴资源的产业化开发提供有效途径。此外，与目前常用于提取果胶的苹果渣[22]相比（提取率19.65%），狐臭柴鲜叶用于提取果胶具有一定优势。但本研究的提取方法仅为酸法，未与其他提取方法进行比较和交互使用，研究结果具有一定局限性，另外，本研究方法虽获得了效果较佳狐臭柴果胶粗品，但对狐臭柴果胶的结构、品质、理化性质等未做评价，其深入研究课题组尚在进行中。