非综合征型唇腭裂的基因研究历史回顾和研究现状

陈 森 李养群 杨 喆 王维新 马 宁 刘启宇

唇腭裂(cleft lip and palate, CLP)是一种常见的先天性畸形，在不同地区和不同人种间发生率有一定差异性，大约为0.03%～0.24%[1]。唇腭裂包括唇裂伴或不伴腭裂(cleft lip with or without cleft palate, CL/P) 以及单纯腭裂(cleft palate only, CPO)，也可以依据是否伴有其他畸形，分为可划分为综合征型唇腭裂(syndromic cleft lip with or without cleft palate, SCL/P)及非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)，其中NSCL/P占70%左右。NSCL/P的致病因素的研究已经有多年的历史，目前的主流观点认为，其发病是环境因素和基因因素相互作用的结果。本文旨在回顾和NSCL/P发病因素有关的重要研究，并且总结最新的研究进展。

一、环境因素

母亲在孕期主动吸烟是已经确认的高危因素之一。目前研究估计，如果进行彻底的戒烟，那么大概会有6.1%的唇腭裂是可以避免的[2]。被动吸烟(二手烟)也同样是高危因素之一，转化生长因子α(transforming growth factor- α，TGFα)与吸烟的交互作用对于NSCL/P的发生有影响[3,4]。除了TGF-α以外其他的许多基因也被认为和吸烟有交互作用，但是尚未达成一致意见，例如TGF-β、骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)等[5，6]。

尽管对于孕期饮酒是否会促进唇腭裂的发病尚未达成统一意见，但是在短期内大量摄入酒精会使患病风险升高[7]。但具体机制也不明确。这可能与Msx1(MSH Homeobox 1，Msx1)基因也存在一定的交互[8]。但是研究者尚未达成一致。

环境因素除了直接作用于孕妇和患儿，也同样和基因共同影响胎儿发育。尽管部分观点尚未获得广泛的认可，大量研究者依旧认为吸烟、饮酒、维生素摄入都是与基因易感性密切相关。从目前的研究看来，基因和环境之间的相互作用非常重要，但是获得具有意义和可重复的统计学数据却非常困难[9]。

二、唇腭裂的家族聚集性和致病基因

唇腭裂表现了明显的家族聚集性，表明其具有特定的致病基因。从18世纪开始，就有研究者关注唇腭裂的遗传性，但是迄今为止仍然没有发现确切的发病基因。一般而言，患者近亲的发生概率明显升高。Grosen等[10]调查了1952～2005年间6776例患儿和54229名亲属，最终认为CL/P患者第1代亲属患病率最高，但是到了第2代亲属(兄弟，叔伯、祖父母)明显下降，而到了第3代亲属则与普通人群相似。

尽管唇腭裂的发病风险具有明确的家族聚集性，但是却没有符合孟德尔的遗传规律。从20世纪初开始，逐渐有研究者利用分离分析(segregation analysis)探索NSCL/P家族基因遗传规律。到了20世纪70年代混合模型(mixed model)被提出，混合模型的优点是同时考虑到传统孟德尔遗传规律中的主要基因和具有遗传性的非独立基因。但是这一方法很难获得一个具有可重复性的确切结果。大量的研究还是表明在遗传方面最适合的研究模型是多因素阈值模型(multifactorial threshold model, MF/T)。但是，MF/T无法推测外显率，并且通过其他模型也可以获得相似的结果。所以，目前仍然没有得到一个适用于所有家庭的方法。这也从一个侧面表明，多个基因可能共同影响了唇腭裂患者的发病。

三、唇腭裂的基因定位

基因学的发展为探索非典型的遗传规律提供了更多机会。连锁分析(linkage analysis)和相关分析(association analysis)是最常用的工具。这两者都可以用于发现特定的遗传标记、特定基因和探知突变基因，是从基因组层面探索唇腭裂发病的良好工具，多种基因被发现，染色体1q32附近的干扰素调节转录因子6(interferon regulatory transcription factor 6，IRF6)是最重要的发现。

相比与连锁分析方法，相关分析的统计原理更加简单，获得的数据更有普遍意义。在过去的25～30年里，许多研究者利用相关分析，采用病例对照或者核心家系(患者和父母)的研究方法，检测了大量候选基因，但是结果并不是总能保持一致。原因可能是样本量不足，设计偏倚和基因多样性等。通过对候选基因的测序发现，一些罕见的基因突变可能会修复协同基因的功能，这也可能是研究结果不一致的原因之一[11]。Leslie等[12]利用这种方法结合全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)、核心家系方法研究检测了13个目标基因，其中2个基因(NOG、NTN1)有统计学意义，而4个基因(BMP4、FGFR2、MSX1、PTCH1)无意义，但是这结果具有争议，和许多研究者的研究结果相互矛盾，需要深入研究。

进入21世纪后，大样本单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和GWAS逐渐普及，并广泛应用于唇腭裂的基因研究，大量的基因被发现和验证，其中最重要的是IRF6、MAFB、VAX1、WNT信号通路、Msx1和BMP信号通路。

1.IRF6： IRF6与NSCL/P发病有关的结果得到了GWAS研究结果的验证，但是由于人群基因的特异性，部分结果难以复制[13]。IRF6也被证明是P63的作用靶点之一，目前也发现P63可以导致多种以CLP为临床表现的综合征，P63通过增强子的作用促进IRF6的转录，这个过程中的任何变异都会促使CL/P的发生[14,15]。

2.MAFB：肌腱膜纤维肉瘤癌基因B型同系物基因(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)基因编码碱性亮氨酸拉链转录因子。在一个亚洲的研究中，MAFB基因和NCL/P发病呈现强烈的相关性，在独立重复样本中，这一结果也被验证有效(欧洲人，P=0.0007；亚洲人，P=0.0009)。在菲律宾人中发现的一个和CL/P有关的错义突变(H131Q)位于保守序列中，这提示一些MAFB两侧基因区中的转录因子结合位点也可能会影响CL/P发病[16]。

3.VAX1：在Beaty等[16]的研究中，CL/P患者都在10q25染色体附近发现了腹前同源盒(ventral anterior homeobox 1，VAX1)基因的2个SNPs(rs7078160和s4752028)高表达。VAX1编码DNA结合的转录同源盒的调节因子。同时，在如欧洲、中非、东南亚等人种中的研究也表明了VAX1多态性与NSCL/P的关联[17]。

4.WNT信号通路：尽管WNT(wingless -type MMTV integration site family)信号通路和NSCL/P之间的关系尚未被GWAS验证，但是研究表明WNT信号通路相关的基因突变与NSCL/P密切相关，Wnt9b基因被认为是NSCL/P的高危基因，在唇部发育形成过程中扮演重要角色[18]。

但是这些结果在不同人种之间差异很大，这是因为技术本身的局限性，也可能是由于GWAS会忽略部分在发育过程中起到了重要调节功能的调节基因[19]。

四、后GWAS时代

GWAS后，一些新的技术逐渐成熟，如外显子组测序(exome sequencing)、拷贝数变异(copy number variation,CNV)和全基因组测序研究(whole-genome sequencing studies，WGS)，这些技术的成熟有利于更加复杂的实验。2014年Peyrard-Janvid等[20]对一个Van der Woude综合征的大家族进行了外显子组测序，将GRHL3(grainyhead-like3)基因作为其重要候选基因之一，大约有5%的患病是由于GRHL3引起。Bureau等[21]通过患者NSCL/P患儿的二级和三级亲属的外显子测序发现了他们都具有上皮型钙黏素(E-cadherin，CDH1)基因的突变。进一步的研究发现，一些其他少见的突变都是通过作用于CDH1基因发挥作用，因此CDH1基因也已经成为重要的候选基因之一[22,23]

在Maarse等[24]在系统回顾中阐明CNV已经逐渐成为研究NSCL/P的一个重要方法。Younkin等[25,26]也利用CNV陆续发现了ch7p14.1、ADAM3A、MGAM和ADAM5A等具有研究潜力的基因。

唇腭裂的基因研究迅速发展，目前已经可以使用标准化工具研究复杂的遗传规律。可以确定的是，唇腭裂的发病有明确的基因基础，但是肯定涉及非常多的基因，并且与环境因素密切相关。近几年，无论是技术水平还是统计方法均快速发展，但是在病因不一致性的研究方面总是力不从心，特别是对一些少见畸形更是如此。目前的技术已经可以做到完整的基因组测序，但是，详细恰当的设计和有效的分析仍然是最重要的。

唇腭裂基因方面最大的挑战在于没有一个有效方法去处理庞大而复杂的数据。尽管可以对患者的家族进行追踪、绘制遗传图并进行基因测序，但是如何处理、分析、解释获得的生物信息却非常困难。特别是一对特定的夫妻可能在多个基因位点上存在多个变异，如何将获得的基因信息转化为有效的临床工具极其困难，具体的预防和和治疗时机也很难把握。