甲基苯丙胺疫苗的研究进展

朱 喆 廖泫栋 曾发明 李映波

近年来，滥用合成精神药物对社会造成了巨大的健康负担。甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)是合成苯丙胺类药物的一种，苯丙胺类兴奋剂滥用是一个全球性的现象，在过去的10年里，苯丙胺类兴奋剂的使用明显增长。METH和其他苯丙胺类兴奋剂对中枢神经系统的影响包括情绪增强、自尊改变、警觉性增加、攻击性和性欲加强等；此外，滥用METH导致心血管和脑血管病变的发生率增加[1]。METH对多巴胺信号通路的影响主要是由于其强大的奖赏效应即成瘾性[2]。

METH作为一种新型合成毒品，是世界上滥用十分广泛的非法药物。目前没有批准可用于治疗METH成瘾的药物，而主要采用行为疗法进行治疗，但效果欠佳。关于METH成瘾的药物研发主要靶向于受METH影响的受体或神经递质系统。潜在的药物治疗通常因严重的药物相互作用和药物不良反应谱而复杂化，以及METH成瘾者由于使用METH而导致的结果例如睡眠中断、饮食行为改变等而在临床评估时降低了其药物依从性和功效[3]。此外，METH戒断患者的复发率高，这对METH成瘾的有效治疗是一个重大的挑战。迄今为止，针对可卡因、尼古丁及阿片类药物疫苗的研究已被证明能够有效衰减相关药物的反应，并且关于可卡因及尼古丁疫苗的临床试验也正在进行[4, 5]。这些疫苗的研究成果也激励了METH疫苗的研发。

一、疫苗作为治疗METH成瘾的策略

能够使机体产生特异性免疫反应的抗原的最小分子质量是10000。而METH的相对分子质量小，不能被免疫系统识别，因此其本身不具免疫原性。将其进行结构修饰即通过一段连接的基团与大分子的蛋白偶联后，免疫系统能够识别并产生特异性抗体。当METH进入机体，抗体可与METH结合，在循环系统内形成抗体-METH复合物，形成的复合物相对分子质量大以至于无法穿过血-脑脊液屏障，因此，会降低METH进入大脑的速率和数量，然后抗体结合的药物再在平衡状态下从抗体结合缓慢释放作为残留的游离药物被代谢和消除。降低METH进入大脑的速率和数量应该减弱其引起的行为效应，包括奖赏效应。研究显示血液中的抗METH抗体通过减少和减慢METH进入血-脑脊液屏障，阻断由METH诱导的自发活动、体温调节和精神运动，并抑制其自我给药[6～9]。

此外，疫苗不同于传统的治疗药物成瘾的药物，其不会阻止药物与特定的神经元受体结合以对抗药物的效应，与此药效学的方法相反，抗药物抗体是降低多器官系统特别是大脑中可用药物浓度的药代动力学拮抗剂[10]。由于抗METH抗体本身不调节脑内或周围的药物受体，它们的不良反应是最小的[11]。疫苗免疫可以通过免疫系统提供长期的抗体保护，其刺激免疫系统产生的IgG抗体半衰期长，它们的作用时间比小分子长得多[12]。尽管对于微生物疫苗这种保护可以维持数年到数十年，而小分子疫苗的研究目前显示每次加强免疫后仅能维持几周到几个月，但相比其他治疗方法，疫苗仅需数次接种便可以替代每日的药物剂量，更为经济有效且具有最好的患者依从性[12]。类似METH的结合疫苗是通用的，理论上可以设计为靶向任何药物或药物组合。

二、 METH疫苗的研究现状

1.以血蓝蛋白作为载体蛋白：Miller等[13]研究发现以钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)为载体蛋白偶联METH半抗原(MH6)的抗METH疫苗(MH6-KLH)免疫大鼠，可以阻断由METH诱导的体温调节和精神运动，并且减少由METH引起的自发活动；对疫苗组与对照组大鼠的药代动力学研究显示其血清中METH浓度更高，且脑内METH浓度更低，并且每只小鼠中METH的浓度与其自身抗体效价相关。之后研究人员用该候选疫苗接种大鼠模型，发现其能够抑制METH的自我给药，并且在维持期间产生了瞬时的和剂量依赖性的自我给药效应。与对照组比较，MH6-KLH接种大鼠血液中METH浓度在急性METH注射后更高，且与抗体效价呈正相关[9]。表明主动免疫能够减弱METH的生理和行为效应。

Hambuchen等[2]合成一种新的类METH半抗原METH-SOO9，和免疫血蓝蛋白单体(immunocyanin monomers of Keyhole limpet hemocyanin, ICKLH)偶联制成METH偶联疫苗ICKLH-SOO9，然后和抗METH单克隆抗体mAb7F9联合使用，在大鼠中检测其安全性和潜在的治疗效果，联合抗体治疗安全地实现早期的高抗METH抗体应答，并且在整个研究中一直存在，即使在4个月后，METH疫苗抗体仍能显著降低由0.56mg/kg剂量产生的METH脑内浓度[2]。抗METH单克隆抗体虽然昂贵但却是有效的，它在人体内的半衰期为3～4周，通过加量控制能够实现可预测的抗体浓度来对METH引发的效应产生潜在的即时保护作用[14]。通过2～3个月或者更长时间的METH偶联疫苗的定时主动免疫可延长血液循环中抗METH多克隆抗体的浓度[4]。然而，在主动免疫所需的时间段内，患者没有达到有效的抗METH多克隆抗体的保护水平，甚至在血液中的最大抗METH多克隆抗体最终浓度也远低于用单克隆抗体实现的水平[15]。事实上，不稳定的多克隆抗体浓度被认为是尼古丁和可卡因结合疫苗2期临床试验失败的主要原因[16, 17]。结合由抗METH单克隆抗体药物提供及时高水平的保护以及由METH结合疫苗提供长时间持续的多克隆抗体反应可为患者提供互补的治疗优势，在METH复发的关键时间由两种治疗方式共同增加免疫应答。在可卡因及尼古丁疫苗研究中，在大鼠中联合主动免疫和单克隆抗体的治疗方式与单种治疗方式比较，其总体疗效均有所提高[5, 18]。METH疫苗与抗METH的单克隆抗体适时适当的联合使用来治疗METH成瘾可能比单独的疫苗使用效果好，可以成为一种较好的治疗策略。

2.以破伤风类毒素(tetanus toxoid, TT)作为载体：研究人员通过半抗原的设计、佐剂、载体蛋白和配方的优化，得到其效果最佳的疫苗。最优的半抗原设计是通过METH结合H-Gly-OtBu后脱保护得到的，然后与TT偶联，与铝佐剂或者CpG ODN联合免疫，在小鼠中产生强大的抗METH免疫反应，减少由METH诱导的运动活性[8]。Haile等[7]合成METH半抗原琥珀酰METH(succinyl-methamphetamine, SMA)，与破伤风类毒素偶联为SMA-TT，然后吸附于氢氧化铝制成METH疫苗，其选用破伤风类毒素作为载体蛋白，用氢氧化铝作为佐剂的目的是可用于人类。将疫苗免疫小鼠来评估其产生抗METH抗体、改变条件位置反射获得和恢复以及阻止METH脑渗透的能力。研究发现该疫苗刺激产生抗体，减弱条件位置反射的获得和恢复，并且疫苗组小鼠很大比例表现出条件位置厌恶，并且，与对照组比较降低了METH脑内的水平。该研究结果支持可进一步开发能够应用于人类的METH疫苗。

3.其他载体：Carroll等[19]合成巯基半抗原(S)-(+)-3-(9-羧基甲氧基)甲基苯丙胺，与马来酰亚胺激活的蛋白偶联生成METH疫苗，半抗原在卵清蛋白和牛血清蛋白两种载体上具有高度可控的表位密度，在小鼠中产生较好的免疫反应，并且由该疫苗在小鼠中产生的单克隆抗体显示出非常高的亲和力。该半抗原显示出的与活性载体蛋白的高效共价偶联表明，该方法对大规模生产METH疫苗具有成本效益。

一种METH疫苗是通过将METH半抗原通过共价连接到包含了构象位移的，选择性反应的分子佐剂YSFKPMPLaR (EP54)的肽结构上而设计的。将包含有EP54佐剂的METH疫苗免疫大鼠后产生了METH特异性的血清抗体，这是改变METH自我给药的首要条件；免疫增加了METH自我给药的药代动力学拮抗作用；在METH自我给药期间和不久之后免疫血清结合METH修饰的靶蛋白的能力显著下降，说明游离的METH被有效结合[20]。

三、影响METH疫苗效力的因素

任何小分子活性疫苗的成功是由3个因素密切决定的：抗体特异性、亲和力和抗体效价[12]；而疫苗制剂的功效可通过几个参数改变，包括用于刺激免疫反应的载体蛋白、加强免疫原性的佐剂、半抗原的设计以及与载体蛋白偶联的化学结构。

METH疫苗由一个METH类似半抗原与载体蛋白偶联形成。METH类似半抗原由METH骨架分子结构在一个位点连接间隔基团，连接体的另一端终止于能容易形成抗原载体蛋白的共价连接的官能团。连接体还用于将半抗原与载体蛋白间隔在最佳距离，以最大限度地提高对METH的亲和力和特异性[19]。连接体两端形成的化学键和该间隔臂的长度(如9个碳原子)对免疫应答的质量[亲和力和特异性(METH)和数量(即抗体量)]至关重要[21]，因此半抗原的设计就显得尤为关键，需要尽可能保留药物的天然化学结构以产生具有最高药物亲和力的抗体，显然，连接体的加入改变了其结构，但可以进行战略性的设计最大限度地减少关键药物功能的破坏。在METH中，保留仲胺是获得高亲和力抗METH抗体的必要条件，含有叔胺或酰胺的半抗原未能产生有效的药物结合抗体，此外，对于连接体的选择更偏向肽段而不是采用烷基连接[8,22,23]。

研究人员合成一系列的METH半抗原，利用一段不同氨基酸，不同肽链长度的一段多肽与载体蛋白相连，来研究连接器的效应，发现这些参数中的每一个的独立变化都会导致疫苗接种诱导的抗体的数量和质量的改变；结果发现包含一种结构简单的氨基酸连接器的METH疫苗有利于限制METH通过血-脑脊液屏障进入脑[24]。Moreno等[25]通过分子模拟系统生成一系列靶向最稳定的METH构象的半抗原设计，然后将合成的半抗原与KLH偶联，免疫小鼠后进行血清学分析，发现不同的半抗原设计所产生的抗体效价与抗体亲和力均不同。一系列的比较研究证明了半抗原设计对于药物滥用疫苗的重要性，半抗原的设计对于免疫识别至关重要，因为它影响靶抗原的递呈，进而影响免疫反应的质量；半抗原必须能够代表真正的小分子药物，其诱导的免疫反应才能够针对目标药物。

载体蛋白是偶联疫苗的重要组成部分，因为它是T细胞表位的来源。这些表位是通过抗原递呈细胞激活T细胞所必需的，而活化的T细胞可以刺激B细胞，即T辅助细胞。这些细胞之间的同源相互作用通过MHCⅡ递呈与T细胞表位相关的半抗原而发生。MHCⅡ递呈首先是免疫交联物的摄取和胞内蛋白水解消化，B细胞对免疫偶联物的一个重要处理过程是半抗原对多个B细胞受体的交联作用。所以需要足够程度的载体蛋白半抗原，即表位密度，以诱导有效的B细胞受体交联用于下游募集T辅助细胞[11]。很少有研究比较各种蛋白质作为小分子半抗原载体的功效，在海洛因疫苗研究中发现免疫原性的趋势为KLH<白喉类毒素

疫苗优化的一个领域是佐剂的选择，用于通过增加局部炎症、刺激抗原递呈细胞和充当仓库来增强局部免疫应答。Arora等[23]用SMA-TT联合氢氧化铝佐剂诱导小鼠产生抗体并能够减弱条件位置反射的获得和恢复。该研究组又用相同的METH疫苗SMA-TT配伍E6020佐剂(一种Toll样受体4激动剂)，在最适剂量下抗体的峰值水平较铝佐剂增加了2倍，接种疫苗的小鼠水平活动明显减少，但对垂直活动以及条件位置偏爱无明显影响。在对ICKLH-SMO9疫苗佐剂的优化研究中，分别用氢氧化铝、SAS (Sigma adjuvant system, SAS)、GLA-SE (glucopyranosyl lipid A-stable emulsion, GLA-SE)作为佐剂比较有明显差异，免疫效果GLA-SE>SAS>氢氧化铝，但产生的抗体亲和力没有受到影响[11]。相同的疫苗与不同佐剂配伍的免疫结局是不同的，佐剂研究在METH疫苗的研发中是不可缺少的一部分。

METH疫苗需要相当高的效价水平以达到有效性，因为必须阻断大量的药物以阻止药物引起的效应。相反，针对病原体的疫苗对阻止感染的滴度要求较低。因此，不仅需要考虑半抗原的设计以及载体蛋白的选择，疫苗的免疫方式、剂量以及免疫时间表也会影响疫苗的效力。结合接种疫苗通常注射3次，每次注射间隔2～4周。效价在注射后2～4周达到高峰，在下一次注射前的2～3个月衰退。

四、展 望

疫苗为治疗METH成瘾提供了一个新的途径，在无相关有效药物治疗的情况下，是一个很值得考虑的治疗方法。虽然这些疫苗在临床前显示出较好的效果，但这些研究成果还未能转化到临床研究，所以努力提高疫苗的效力特别是疫苗的免疫原性是势在必行的。发展新的半抗原合成策略，使用免疫原性更强并且特征良好的载体，更好的佐剂以及一些尖端的生物材料将会生产出更为有效的下一代METH疫苗。除了疫苗，其他生物制品如抗药物单克隆抗体及其他药物的研究也正在进行临床前及临床研究[10]。在研究中可以将疫苗、抗药物单克隆抗体和(或)药物作为联合疗法，以规避每个单独的治疗方法的缺点或针对特定患者群体的个体化治疗。在研究和评估潜在候选疫苗时，研究人员应该考虑性别对疫苗免疫原性的影响，这已经在可卡因疫苗的相关研究中提出。此外，药物遗传学也可能影响疫苗的效果，例如，具有多巴胺β-羟化酶基因变体的个体(其降低胸径水平)对可卡因疫苗的治疗效果比具有正常多巴胺β-羟化酶水平更好。应用药物遗传学原理并识别相关的遗传亚群将在未来的试验中发挥一定的作用。