HPV相关癌症治疗性疫苗的研究进展

靳大川 左雨点 武淑芳 郭 师 李 聪 路德荣 周 涛 郭宝强

自从1977年Zur Hausen等首次报道人乳头瘤病毒(HPV)是人宫颈癌的致病因子，至今40余年。作为乳头瘤家族的成员之一，目前已经发现200种以上的HPV亚型。它是公认的世界上最常见的性传播感染的病原体，每年有1400万人以上获得新发HPV感染。据估计，一个人一生中感染HPV的危险性达到70%～80%[1]。HPV全球人口的总感染率更是可能高达11.7%[2]。

虽然大部分HPV感染是一过性的，1～2年内可以被人体自然清除掉,但是仍有约10%引起持续性感染。这是HPV引起癌前病变和最终发生恶性转化的先决条件。虽然整个癌变进程可能长达10～20年，仍然需要足够的重视[3]。目前国际癌症研究组织(IARC)认定的有致癌潜力的HPV亚型有12种亚型，还有13种可能致癌的亚型。这些亚型被称为高危亚型(HR-HPV)。其他亚型被称为低危亚型(LR-HPV)。

HPV是IARC认定的11种一类生物致癌因子之一。目前已经发现HPV高危亚型持续感染与多种恶性肿瘤的发生有关，HPV引起的癌症占所有感染相关恶性肿瘤的1/3左右，占所有人类恶性肿瘤的4.5%～5.0%[4]。它不但与90%以上的肛管癌和宫颈癌有关，还与大约70%的阴道癌、外阴癌、口咽部癌以及60%以上的阴茎癌有关[4～6]。近年来，HPV相关癌症的发生率不断上升[7]。而癌症是世界上排名第2位的死因。因此，有关研究越来越引起重视。

一、HPV的分子生物学特点和致癌机制

HPV是无包膜、有20面体衣壳的双链环状DNA病毒，基因组约8000，主要编码6种早期调节蛋白，分别是E1、E2、E4、E5、E6和E7; 2种晚期结构蛋白，分别是L1和L2; 以及一个非编码上游调节区(URR)。各个开放读码框架紧密重叠盘绕并接受顺式调节元件转录调节。其基因转录受宿主细胞分化状态的影响，分为早转录、中转录和晚转录，从不同的起始位点开始，产生不同的病毒蛋白[8]。

当皮肤、黏膜有微小损伤时，HPV 通过损伤点感染基底层上皮细胞。HPV的L1/L2衣壳蛋白可以结合上皮细胞表面的受体，并通过内吞侵入到上皮细胞的内部。但最终只有病毒的基因组染色体和L2蛋白构成的复合体进入细胞核[9]。这个入核过程只发生在细胞进行有丝分裂、核包膜分开的时机。E2蛋白有DNA结合位点，可以通过和病毒基因组URR区有反式调节激活作用的一个保守区(E2BS)结合，将病毒基因组与宿主细胞染色质锚定在一起。这个锚定作用是病毒引起持续性感染的关键。

E5是一个小的跨膜蛋白，和E6协同作用促进挖空细胞的形成，这是HPV感染诊断的标志性细胞。E6和E7蛋白是HR-HPV致癌的主要蛋白。E7蛋白和pRb基因结合并使之灭活，导致细胞增殖失去控制。 抑癌基因p53是诱导细胞凋亡的重要基因。E6蛋白与之结合，可以使p53泛素化并降解，抑制细胞凋亡。二者协同作用，最终导致宿主细胞的恶性转化[6]。另外，大部分HPV相关的恶性肿瘤，可以发现病毒基因组整合进宿主基因组DNA的现象。这个整合过程往往会在基因组线性化的过程中破坏E2基因序列，并随之破坏E2介导的病毒基因组的表达。E2蛋白对E6/E7基因的表达起到转录抑制作用，是重要的转录抑制因子[10]。E2基因的破会随之导致E6/E7基因表达失控，引起宿主细胞基因组的不稳定和恶性转化[8]。

二、HPV治疗性疫苗

已知E2、E5、E6、E7是公认的HPV免疫逃避和恶性转化的关键性蛋白。目前处在研究阶段的治疗性的HPV疫苗，主要选择病毒的E6/E7蛋白作为靶抗原[11]。因为E6/E7蛋白是HPV的主要致癌蛋白，不会通过突变逃避免疫监视，且在细胞内有高表达[10, 11]。但是E6/E7蛋白对p53和pRb基因的灭活潜力，可能引起宿主细胞的恶性转化，故多采用重组手段将E6/E7蛋白的编码基因进行人为的修饰改造。保留其抗原性，又不诱发宿主细胞恶性转化。

E5蛋白一般在癌变的细胞中不表达，可能只在病毒导致的恶性转化的早期阶段起作用，因此多不作为治疗性疫苗的靶抗原。理论上E1/E2蛋白也可以作为治疗性疫苗的靶蛋白。因为它们对于病毒复制的起始和维持有重要作用，是病毒DNA整合进宿主基因组以前需要早期高水平表达的蛋白。但是在病毒整合进宿主细胞基因组的过程中，E2、E4、E5、L1、L2基因常常被破坏或丢失，因此不是理想的靶抗原[10, 12]。

当前处在研发阶段的HPV治疗性疫苗主要有以下几类：

1.核酸疫苗：是以DNA或RNA分子构建载体，并使之在宿主细胞内表达HPV特定靶抗原蛋白，刺激机体产生有效的免疫应答。

(1)DNA疫苗：原理是利用一个有强大病毒启动子的重组细菌质粒，携带重组的靶抗原基因和转录终止序列，采用有效的手段使之进入人体细胞进行表达，刺激人体免疫系统产生有效的免疫应答[6]。优点是费用低廉、应用简单、产品稳定、易生产纯化。另外，因为DNA不具有抗原性，不刺激机体产生针对载体的免疫应答，所以可多次接种[10, 13]。主要的安全性顾虑是重组DNA本身可能会整合进宿主细胞DNA，但目前尚无任何相关证据[6]。2015年美国Trimble等通过一个多中心联合的随机双盲对照Ⅱ期临床试验证实了美国Inovio制药公司HPV-DNA疫苗VGX-3100的疗效。他们对167例分别来自美国、南非共和国、印度共和国、加拿大、澳大利亚、乔治亚民主共和国以及爱沙尼亚共和国，HPV16/18阳性、组织病理学证实为CIN2/3的女性患者，在第0、4、12周的时候肌内注射VGX-3100，然后应用VGX-3100进行电穿孔转化治疗。发现49.5%的治疗组患者病变得到了逆转，而应用了安慰剂的对照组只有30.6%的患者有逆转。这也是世界上第1种同时成功诱导针对HPV的E6/E7蛋白，产生有效的细胞免疫和体液免疫应答的治疗性HPV-DNA疫苗[14]。VGX-3100也是迄今为止最成功的HPV的治疗性DNA疫苗[10]。

(2)RNA疫苗：与DNA疫苗比较，mRNA只要通过内吞作用进入宿主细胞的细胞质就可以直接开始转录，不需要像DNA一样进入细胞核才可以。但是RNA极不稳定，易降解，而且不能在细胞之间传递。相关的研究很不成熟，还远没有进展到临床试验的程度。

2.肽类疫苗：是通过抗原递呈细胞，例如树突状细胞，摄取和递呈肽片段抗原给CD8+T细胞，从而产生免疫应答。优点是稳定、安全，易于大规模生产，耐受性好，可引起广泛的T细胞应答[6]。

肽类片段本身免疫原性比较差，因此需要一些措施增强其免疫原性，例如同时使用免疫佐剂，或者采用融合蛋白的形式，以刺激机体产生更强的免疫应答，获得更好的治疗效果。已经有研究对加用Montanide ISA-51佐剂的HPV肽类疫苗进行的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，做了毒性、安全性和免疫原性方面的研究。未观察到严重不良反应。仅少数人出现乏力、发热等一过性流感样的症状。酶联免疫斑点试验证实，加用免疫佐剂的HPV肽疫苗诱导产生了强烈而广泛的免疫应答[1]。美国Nakagawa等采用新的免疫佐剂，应用含有HPV16 E6蛋白的4个肽片段的疫苗PepCan，对24例活检证实的CIN2/3患者进行了Ⅰ期临床试验，观察到83%的病例在注射50μg剂量治疗后，病变得到明显的逆转[15]。目前正进行Ⅱ期临床试验[6]。Daayana等采用融合蛋白形式的HPV肽疫苗TA-CIN，对19例有外阴表皮内瘤变2级/3级的患者，进行了Ⅱ期临床试验，取得了明显的治疗效果。在应用疫苗后第10、20、52周，分别观察到有32%、58%、63%的患者，病变得到了完全的逆转。并在患者病变组织内发现了大量的CD8+和CD4+T细胞浸润[10]。

3.蛋白质疫苗：HPV蛋白抗原包含大量的抗原表位，但是通常更倾向于激活MHC Ⅱ类分子途径，诱导体液免疫应答。但是对于T淋巴细胞介导的细胞免疫，激活效果比较弱[6, 16]。而细胞免疫应答对于终止CIN的进程、病毒的清除、癌前病变的逆转等是一个关键性因素，体液免疫应答主要是预防HPV感染的主要方面[6, 17]。因此，需要在疫苗里采用来自E6/E7蛋白的MHC Ⅰ类分子限制性肽，可以产生更强的细胞免疫应答[16, 18]。应用佐剂也可以增强其细胞免疫应答[6]。

法国Genticel公司开发的ProCervix(GTL001)是 HPV16/18的E7蛋白和来自百日咳杆菌的去毒化腺苷酸环化酶的融合蛋白，采用咪喹莫特作为佐剂，对47例女性HPV16/18感染者进行了随机、对照、双盲的Ⅰ期临床试验，皮内注射不同剂量的GTL001，评估其安全性、耐受性和治疗效果[17]。研究发现GTL001的引起的不良反应为轻中度，可以耐受，在600μg剂量的时候，病毒的清除效果最好，可以诱导有效的细胞免疫应答。该公司随后开发的第2代多价HPV治疗疫苗——GTL002，目前正在进行Ⅱ期临床试验。

4.活载体疫苗：是利用重组消除致病性的活细菌或者病毒作为载体，在宿主细胞内复制和扩散靶抗原，然后通过MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ途径递呈抗原，刺激CD8+细胞毒T细胞和CD4+辅助性T细胞(TH细胞)，从而产生强烈的细胞和体液免疫应答[13]。

(1)细菌性活载体疫苗：常用的细菌载体包括单核细胞增多性李斯特菌(Lm)、干酪乳杆菌、乳酸杆菌、沙门菌等。最常选用Lm作为细菌载体。它是革兰阳性菌，不产生脂多糖内毒素；又是胞内菌，能利用MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ途径激活CD8+和CD4+细胞，也可以在相邻细胞间传播。还可以触发固有免疫应答，像天然免疫佐剂一样进一步增强抗原特异性T细胞应答的强度[10]。这一类的疫苗有的已经进入了Ⅲ期临床试验阶段，例如美国Advaxis公司开发的AXAL疫苗于2016年得到FDA的批准。Tomoyuki等进行的一个Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，17例有CIN3病变的患者口服干酪乳酸菌为载体的HPV疫苗GLBL101c，治疗9周后，有9例患者的病变逆转为CIN2，5例患者的病变逆转为LSIL。并且没有观察到明显的不良反应[10]。

(2)病毒性活载体疫苗：病毒本身有感染宿主细胞，并将其DNA送入细胞内的自然特性，这是其作为载体的优势所在。这一类疫苗的原理，是改造病毒的基因组，将HPV靶基因替代病毒基因组中不重要的部分，并重组消除病毒致病基因[6]。这样改造后的病毒感染宿主细胞，基因组就可以在细胞内转录和表达靶抗原，并且不会引起其他疾病。常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、α病毒、牛痘病毒等[13]。病毒载体疫苗是最有希望的HPV抗原特异性免疫治疗。这类疫苗的优点是可以快速大量生产，可以诱导体液免疫和细胞免疫应答。

重组修饰的牛痘病毒Ankara(MVA)疫苗可以表达HPV16/18的E6/E7蛋白，在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，有28%的晚期宫颈癌患者，接种后产生了HPV特异性的CTL应答。在另一个Ⅱ期临床试验中，83%的42～54岁患者，病变至少缩小了40%。最近的一个包含1356例男性和女性患者的Ⅲ期临床试验发现，有效率达到了90%。所有男性患者的病变得到了完全的根除[19]。腺病毒：对多种细胞有广泛的趋向性，可以通过重组携带6500的外来DNA片段，进入细胞核后持续性以游离形式存在。因此腺病毒是一个理想的病毒载体。但是因为腺病毒在人体是一个常见的病毒，因此很多人体内有针对腺病毒的高滴度中和性抗体。这样不得不选用一些少见的亚型，例如Ad26、Ad35；或者采用其他宿主的腺病毒，例如羊、猪、牛、黑猩猩等。其中以黑猩猩携带的腺病毒最理想，因为在人类的流行性很低，而免疫原性又很强大[6, 20]。Wunderlich等采用少见的腺病毒亚型Ad26、Ad35作为载体，开发的针对E2/E6/E7的治疗性HPV疫苗正在进行Ⅰ期临床试验[21]。

RNA复制子疫苗是用来自α病毒的某些RNA病毒重组得到的RNA病毒载体疫苗。这类病毒包括辛德毕斯病毒、委内瑞拉猪脑炎病毒等[10,22]。RNA复制子能自我复制，进行持续性的抗原表达，产生增强的免疫原性。这类疫苗例如VP22-E7、E7-VRP疫苗等。其中E7-VRP疫苗的动物试验的结果很惊人，使67%的荷瘤小鼠的肿瘤消失。另一种RNA复制子疫苗，Vvax001疫苗，正在进行Ⅰ期临床试验[10]。

5.基于细胞的HPV治疗疫苗：是将分离出的活细胞，在体外转导或其他处理，使细胞可表达靶抗原而刺激机体产生免疫应答。然后将处理后的细胞输到患者体内。

树突状细胞(DCs)本身就是最有效的专业抗原递呈细胞，能激活固有和获得性免疫系统。通过将抗原递呈给MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子途径，能诱导强大的CD4+和CD8+T细胞免疫应答[13]。这一点与DNA疫苗及肽类/蛋白质疫苗比较很有优势。但是DCs的缺点也很明显，不易大规模生产，生命周期短，质量控制不易、缺乏理想的接种途径等[10]。这一类疫苗有的也已经进入Ⅰ期临床试验。发现患者对疫苗耐受性良好，对于晚期宫颈癌也显示出疗效。

过继细胞传输(ACT)是另一种基于细胞的疫苗治疗方式。这种方式是在体外生产抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)，然后输入到患者体内进行治疗。这个方法的优势是能在体外生产大量的抗原特异性CTLs，体外激活使其具有抗原性。并且在回输治疗前，可以去除免疫应答的抑制性细胞，例如Treg细胞等。从而获得更好的治疗效果。这类疫苗也已经进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，对HPV相关癌症患者进行试验治疗。观察到部分患者已经转移的HPV(+)的恶性肿瘤发生了消退，证明这是一种有效的治疗手段[10]。

其他还包括HPV特异性T细胞(HPVST)疫苗治疗，这是直接提取和处理HPV相关恶性肿瘤患者体内的血液中的T细胞。使其对癌细胞的反应更活跃、具有攻击性。而后将这些处理后的HPVST回输到患者体内。这种疗法的I期临床试验也正在进行中。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疫苗是最新的基于细胞的免疫疗法。该法将改造的能表达特定受体，吸引多克隆T细胞到暴露肿瘤相关抗原的表面，进行肿瘤清除[23]。这种方法的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行，关于其可行性、安全性和治疗效果还没有明确的结论。也有用基于肿瘤细胞的HPV疫苗，是将特定肿瘤细胞在体外进行遗传学修饰，使之编码和分泌细胞因子，例如IL-2、IL-12等，以增强其免疫原性。但是考虑到即使是经过基因修饰改造的肿瘤细胞，仍然存在安全性方面的顾虑。因此基于肿瘤细胞的HPV治疗性疫苗不考虑用于癌前病变或癌症早期的情况。

综上所述，研制HPV治疗性疫苗有重要的临床意义和社会价值。虽然预防更为重要，但HPV预防性疫苗价格高昂，限制了其普及应用，尤其在不发达国家更为明显。据报道，2016年中期为止，只有8%的低收入和中等收入国家引入了预防性HPV疫苗[6]。即使在美国这样的发达国家，接种率也只有38%，13～17岁女孩只有大约21%完成了3针HPV预防疫苗注射，并且即使接种了预防性HPV疫苗，仍然有若干没有被预防性疫苗覆盖的HPV高危亚型。而现有的预防性HPV疫苗对于已经感染的HPV的广大患者来说，没有任何治疗效果。因此开发治疗性HPV疫苗是一项很急迫的任务。目前多种HPV治疗性疫苗在进行不同阶段的临床试验，并有若干很有希望的产品。虽然暂时还没有获得批准的商业化的HPV治疗性疫苗，但是相信在不久的将来，价廉物美的治疗性疫苗一定会出现，给广大HPV相关恶性肿瘤患者带来生命的曙光。