自噬在急性肺损伤炎症中的研究进展

瞿利花 陈 超 陈阳晔 李 懿 宋 祁 申 丽

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)可由严重感染、高氧、外伤、药物、机械通气或海水刺激等因素诱发，主要表现为大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润以及肺毛细血管内皮和肺泡上皮细胞屏障功能紊乱，严重时发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1]。Máca等[2]报道ALI是重症监护室患者病死率高的重要原因。目前临床上对ALI的治疗主要是药物如激素类和机械通气等手段来改善患者的呼吸困难，近年来研究表明，调节细胞自噬可以减轻ALI，提示自噬可能成为ALI治疗的新靶点[3]。

自噬是一种进化上保守、动态的细胞分解代谢过程，可由溶酶体降解途径清除受损细胞器、变性蛋白以及入侵的病原体并释放能量，对于维持细胞的正常功能、维持细胞稳态中具有重要的作用[4]。近年来研究表明，自噬在ALI的发生、发展中发挥重要的作用，一方面适度的自噬能抑制炎性因子的释放；另一方面过度的自噬能加重细胞损伤。提示对自噬的调节可能成为ALI治疗的新策略。本综述介绍了自噬途径及其分子机制，以及在ALI模型中的作用。

一、自噬的机制

自噬是将某些细胞内可溶性大分子或细胞器等物质运送至溶酶体进行降解的过程。自噬有3种不同类型，即巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)[5]。巨自噬也称自噬，需通过形成双层膜自噬体将物质递送至溶酶体，微自噬通过溶酶体直接摄取物质而无自噬体的形成，CMA通过分子伴侣协助目标蛋白直接进入溶酶体。在3种自噬中，巨自噬的研究最为广泛，与ALI的发生密切相关。

自噬过程主要包含5个阶段：启动、吞噬泡、自噬体、自噬溶酶体形成以及吞噬物的降解。这些阶段主要由自噬相关蛋白家族(ATGs)调节。ATG蛋白按其作用可分为4类：①Atg1/unc-51样激酶(ULK1)复合物，包括Ulk1、Atg13、FIP200和Atg101,其作用主要是调节自噬启动；②Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Vps34复合物，包括PI3K、Vps34、Vps15/P150、Beclin-1/Atg6和Atg14,参与早期自噬体形成；③两个泛素类似复合物[Atg16L1-Atg12-Atg5和微管相关蛋白轻链3(LC3)/Atg8]， 参与自噬体的延伸与闭合；④两种跨膜蛋白Atg9/mAtg9(参与其运动的相关蛋白如Atg18/WIPI-1)和VMP1，有利于膜的传递形成自噬体[6]。自噬体形成后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，随后由溶酶体蛋白水解酶降解被包绕的物质，生成的小分子物质回到细胞质中重新利用。

二、在ALI中自噬对不同细胞的作用

大量研究结果表明自噬在ALI的炎症发生、发展以及发病机制中起关键作用，但其调控ALI炎症的最终结果与不同的细胞类型有关。

1.巨噬细胞:巨噬细胞通常存在于肺间质和肺泡中，是在感染等损伤时启动肺部炎症的重要细胞。当发生炎症时更多的巨噬细胞聚集到肺部维持和加重炎症损伤。研究发现在脂多糖(LPS)诱导的炎性反应中巨噬细胞自噬能抑制炎性反应，而自噬缺陷小鼠巨噬细胞内大量异常线粒体聚集，进一步激活NALP3炎性体和线粒体活性氧(ROS)诱导炎症发生，同时观察到小鼠死亡率增加[7]。Harris等[8]发现用Toll样受体配体处理巨噬细胞后，促炎性因子能结合到自噬体上，而用自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)能使促炎性因子降解同时抑制炎性因子分泌。在研究盲肠结扎穿孔(CLP)诱发的小鼠模型中，自噬基因Beclin1敲除可增加CLP后患败血症的概率，而CO增强小鼠体内以及巨噬细胞中Beclin1基因的表达，从而促进巨噬细胞对细菌的吞噬作用[9]。

2.中性粒细胞：在ALI早期阶段中性粒细胞大量产生，释放颗粒内容物和促炎细胞因子。Zhu等[10]的研究表明在LPS诱导的小鼠ALI中，中性粒细胞的自噬为中性粒细胞的活化及颗粒内容物的释放所必须的；在ALI期间中性粒细胞自噬增加，导致颗粒内容物释放增加；故通过抑制中性粒细胞自噬，敲低自噬基因Atg5消除了LPS和fMLP对中性粒细胞释放MPO的作用，限制颗粒内容物的释放，从而减轻ALI。而RAPA预处理显着抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导的中性粒细胞趋化和激活，抑制肺中性粒细胞积聚，减少支气管肺泡灌洗液中细胞因子的水平，减轻了肺损伤。

3.肺泡上皮细胞：肺泡上皮细胞有Ⅰ型和Ⅱ型两类。上皮的破坏导致上皮通透性增高及液体转运发生障碍。目前自噬在上皮细胞的研究多数显示过度的自噬能使细胞发生程序性死亡。而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可减少纳米颗粒诱导的上皮细胞死亡并改善小鼠ALI。有研究发现，自噬基因Beclin1敲除或自噬抑制剂3-MA来抑制H5N1感染引起的肺上皮细胞自噬性细胞死亡，从而缓解了ALI，降低小鼠死亡率[11]。

自噬与高氧、香烟烟雾诱导的上皮细胞死亡有关。在高氧诱导人支气管上皮细胞(Beas-2B)中，LC3B-siRNA促进高氧诱导的Beas-2B死亡，而LC3B的过表达对细胞起保护作用,发现这种保护作用与LC3B 调节高氧下细胞凋亡信号基因Fas 有关[12]。一氧化碳(CO)对高氧刺激起保护，并抑制高氧相关的ROS产生，而LC3B-siRNA减弱CO对高氧诱导的上皮细胞死亡的保护作用[13]。然而，研究发现在支气管上皮细胞中，使用LC3B-siRNA能阻断自噬，减弱了香烟烟雾诱导的细胞死亡和凋亡。

4.肺血管内皮细胞:肺血管内皮细胞参与构成呼吸膜，对于维持肺泡腔的干燥发挥重要的作用。血管内皮细胞的损伤引起毛细血管通透性增高，是炎症渗出的重要环节[14]。自噬对于血管内皮细胞正常功能的维持发挥重要作用。Ma等[15]发现高氧增加自噬蛋白LC3B的表达，引起肺内皮细胞线粒体分裂，加重肺损伤。在缺氧条件下引起肺动脉高压，敲低自噬基因LC3B小鼠出现大量肺动脉内皮细胞受损以及肺动脉高压加重。自噬可以调节肺动脉内皮细胞的凋亡和过度增殖从而在肺血管重构中起重要作用。用ssAtg101-TNP形成的纳米颗粒来敲低肺动脉内皮细胞自噬基因Atg101表达，抑制细胞自噬，在缺氧刺激下促进细胞凋亡，细胞通透性增加，而增加自噬逆转了这些现象，提示自噬的调节可能成为内皮损伤有关疾病治疗的新策略[16]。然而，Slavin等[17]研究表明,用自噬抑制剂3-MA或敲低自噬基因Atg5可以减轻LPS诱导的肺损伤模型中肺内皮细胞屏障破坏以及炎性反应，从而减轻了ALI。

三、自噬与ALI炎性介质

ALI发生过程中炎性细胞在肺内的聚集和激活可以产生大量细胞因子，根据其在炎性反应中的作用，这些细胞因子可以分为促炎和抗炎两类。促炎细胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等；抗炎因子包括IL-4、IL-10和IL-13等。这些细胞因子能与自噬相互调节，从而影响炎性反应的过程。

1.细胞因子调节自噬：ALI中，炎性反应的过程与多种细胞因子有关。巨噬细胞产生的细胞因子对自噬蛋白调节起重要作用。研究表明Th1细胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和TGF-β为促炎因子，具有诱导自噬作用；而Th2细胞因子为抗炎因子，包括IL-4、IL-10和IL-13，具有抑制自噬作用[18]。用IFN-γ激活巨噬细胞通过Irgm1/IRGM依赖性方式引起分枝杆菌的吞噬体和自噬增加，导致细胞内病原体减少。用TNF阻断剂可以解除IFN-γ诱导的吞噬体的成熟，这表明IFN-γ诱导的吞噬体成熟和自噬可能依赖TNF-α。研究表明，在不同细胞中TNF-α可以通过不同的机制刺激细胞自噬，发挥不同的作用[19]。例如，在血管平滑肌细胞中TNF-α可以通过激活Jun激酶信号通路以及抑制Akt活化来上调自噬基因LC3和Beclin1的表达[20]。在乳腺癌细胞中TNF-α通过ERK1/2途径诱导自噬，而NF-κB的激活可以抑制TNF-α诱导的自噬，这依赖于ROS的产生。IL-6和 IL-1被证明都可以刺激自噬[21，22]。

研究表明，在饥饿或炎症刺激诱导下Th2细胞因子如IL-4、IL-13和IL-10通过不同途径抑制自噬，饥饿引起的自噬抑制依赖于Akt途径，RAPA诱导的自噬依赖于STAT信号通路。另外，其他相关的细胞因子，如生长因子和趋化因子也参与自噬的调节。Ding等研究已表明TGF-β可增加自噬基因Atg7和Atg5的表达并诱导自噬体形成。趋化因子CCL2(单核细胞趋化蛋白-1)能刺激自噬和上调抗凋亡蛋白的表达。

2.自噬调节细胞因子：自噬可影响细胞因子的分泌。自噬可能通过多种机制调节IL-1β分泌。巨噬细胞的自噬缺失或Atg7、Atg16L1、Beclin1自噬基因敲低以及用自噬抑制剂3-MA处理，在TLR激动剂下能刺激IL-1β分泌，这种影响可能依赖于含有TIR结构域的接头诱导IFN-β(TRIF)、线粒体ROS以及线粒体DNA，也可能与NLRP3有关，或不依赖于TRIF，而是依赖于p38 MAPK信号转导[23]。RAPA诱导自噬可抑制树突状细胞IL-1β分泌，由于IL-1α和IL-1β都能诱导自噬，这可能作为负反馈机制来控制IL-1参与的炎性反应。此外，IL-18、IL-6和TNF-α的分泌也受自噬的调节。自噬的抑制增强了IL-18的分泌，但可减少IL-6、IL-8和TNF-α的分泌[8]。

四、自噬在不同模型中的作用

研究不断发现，自噬与人类疾病存在密切关系。一些研究已揭示了自噬与肺部炎症性疾病(如免疫性肺炎、肺结核、肺癌、ALI等)的发生、发展有关。近几年自噬在ALI动物模型的研究越来越多，例如细菌感染、脓毒症、海水等因素引起的ALI模型，详细的细胞分子机制尚未阐明。这些研究大多数使用自噬激活剂如RAPA和自噬抑制剂如3-MA，来激活或阻断自噬，然后观察ALI的变化。

在LPS诱导的ALI中，LPS引起的过度自噬是ALI发生的主要原因，用3-MA处理能抑制TLR4-NF-κB通路、自噬蛋白的表达，减轻ALI[3]。而饱和氢盐水能下调NF-κB的表达，引起Beclin1转录减少抑制自噬，从而达到治疗ALI的作用[24]。也有报道发现在ALI小鼠中提高自噬能激活SIRT/MAPK信号通路显着减轻了肺水肿和炎性细胞浸润[25]。可见，自噬在LPS诱导的ALI中的作用还远未阐明。

CLP诱导的小鼠ALI中，LC3-II、Atg5表达下调自噬受到抑制，用RAPA激活肺组织自噬，抑制了白细胞浸润、促炎反应和细胞凋亡[26]。与此结果一致的是，过表达LC3的转基因小鼠表现出自噬体的清除增加，中性粒细胞积聚减少，减轻ALI从而显着提高生存率[27]。在海水诱导的ALI模型过程中，自噬抑制剂3-MA能减少肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8的表达并一定程度减轻了肺损伤[28]。在机械通气诱导的肺损伤(VILI)中的作用。López等[29]研究表明VILI能诱导自噬，而在自噬基因Atg4b敲除的小鼠NF-κB激活受抑制机械通气引起的炎性反应改善，减轻肺损伤。

五、展 望

自噬在ALI中具有重要的调节作用。目前关于自噬在ALI中的作用研究取得了一定的进展，自噬的分子机制、途径与ALI关系需进一步探索。由于生物化学途径的相互影响、广泛联系和复杂多变，将有关自噬的基础研究成果转化为应用还需漫长的探索。从治疗角度来看，自噬的调节对ALI具有潜在的治疗价值。由于自噬的功能可能与细胞类型而异，在不同条件下对患者使用自噬诱导剂或抑制剂可能会产生不同的作用。症状改善或恶化可能会难以预测。从诊断的角度来看，自噬的标记蛋白LC3B在细胞凋亡开始之前增加，提示可用作一些ALI的早期生物标志物。今后的研究将集中于自噬详细机制及途径在ALI中的作用，从而为进一步改善ALI策略奠定基础。