多形性腺瘤基因锌指蛋白家族成员在肿瘤中的研究进展

郑舒方，胡唯伟，杨勇，陈真

(中国药科大学药学院，江苏南京211198)

多形性腺瘤基因(pleomorphic adenoma gene，PLAG)家族成员包括PLAG1、PLAGL1和PLAGL2。PLAG1是从染色体易位的多形性腺瘤组织中克隆得到的高表达基因，在70%的多形性腺瘤中异常激活并高表达，Kas等［1］通过分离鉴定得到两种与PLAG1序列高度同源的编码C2H2锌指蛋白，即其家族成员PLAGL1和PLAGL2。PLAG1、PLAGL1和PLAGL2组成多形性腺瘤基因家族，以核蛋白转录调节因子的形式在调节细胞正常生理功能和多种疾病的发生发展方面发挥重要的调控作用。PLAG1作为癌基因参与人唾液腺的多形性腺瘤的染色体易位，在成脂细胞瘤和肝母细胞瘤中高表达。PLAGL1为肿瘤抑制因子，通过调控细胞凋亡和细胞周期进程抑制肿瘤细胞生长。PLAGL2在肿瘤的发生发展过程中的作用及其潜在的致癌机制目前研究还很少，PLAGL2基因及其表达产物与肿瘤的关系在学术界尚存在争议。

1 PLAG家族成员

1．1 PLAG1 PLAG1作为一种致癌基因，参与多种肿瘤的发生发展过程。虽然PLAG1诱导的肿瘤发生的机制已被证实，但PLAG1在正常生理学中的作用尚不清楚。已知PLAG1直接调控多种靶基因，通过胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-likegrowthfactorⅡ，IGF-Ⅱ)等多种生长因子来参与对细胞增殖的调控，这可能是PLAG1在胚胎发育和癌症中的核心作用模式。PLAG1全身敲除小鼠生长迟缓和生育力降低，表明PLAG1参与对生长和发育的调控［2］。

1．2 PLAGL1 PLAGL1/ZAC作为一种抑癌基因，在许多实体肿瘤中被抑制。其抑癌机制主要是与p53通过促进细胞凋亡和停滞细胞周期来抑制肿瘤细胞的生长。已报道在包括卵巢癌在内的多种癌症中，染色体区域6q24-25的高甲基化导致 PLAGL1的转录被抑制［3］。组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase1，HDAC1)参与对PLAGL1的转录调控，HDAC1作为一种转录调节因子，参与对多种抑癌基因的表达调控，如 JunB、Apc2、金属硫蛋白 1、金属硫蛋白2、Prss11。1．3 PLAGL2 PLAGL2作为一种调控发育的PLAG1样原癌基因，在结构和功能上PLAG1和PLAGL2高度相似。与PLAGL1不同，PLAG1和PLAGL2具有相似的DNA结合力，参与对共同靶基因的调控，如对IGF-Ⅱ基因的转录调控。体外试验证明PLAG1和 PLAGL2具有相似的致癌特性，PLAGL2的异常表达使得成纤维细胞能够在无血清培养基中生长。与PLAG1类似，PLAGL2参与对胚胎发育的调控。PLAGL2转录本存在于多种胎儿组织中，但在成人组织中无法通过Northernblot检测到。与PLAG1相比，PLAGL2在成年小鼠组织中广泛表达，包括心脏、大脑、肺、脾、肝、骨骼肌、肾脏和睾丸［4］，PLAG基因在人类和啮齿类动物之间表达差异目前还无法解释。近期在中枢神经系统、外周神经系统、感觉和神经内分泌系统对PLAG基因家族的3个基因的表达模式进行了比较，发现3个成员在其中一些系统中共同表达，但在其他组织中也表现出独特的互补表达模式［5］。

2 PLAG家族的分子结构

PLAG家族蛋白在N端C2H2锌指结构域中高度同源，PLAGL1和PLAGL2分别与PLAG1有83%和90%相似度;C端具有反式激活功能，PLAGL1和PLAGL2与PLAG1相同度不超过30%，但PLAG1与PLAGL2最后28个氨基酸有90%的相似度。基于锌指结构域中DNA结合域之间的高度相似性，PLAG家族成员很可能识别类似的富含GC的共有DNA结合序列并调节相同的靶基因和下游信号通路［6］。

2．1 PLAG1 PLAG1基因位于染色体8q12，主要的转录产物长度为 7．3kb，也有 3 种较短的剪接体：7．2/7．0kb，和 6．9 kb。PLAG1由5个外显子组成，前三个外显子因缺少编码相应RNA的启动子序列不可翻译，第四和第五个外显子含有1593bp的编码序列，可翻译成56kDa的蛋白。PLAG1的N末端含有7个C2H2锌指结构域，负责与DNA的结合，C端包含具有转录激活活性的丝氨酸富集区域。PLAG1已被证明为核蛋白，在其结构中存在两个核定位信号：一个是N端锌指结构域，另一个是位于N端的核转运蛋白a2识别位点，参与蛋白质与核孔对接［7］。人PLAG1同小鼠有96%的相似性，位于4号染色体上，由6个外显子组成，含有1500bp的编码序列，包含第五个外显子的3'末端和第六个外显子的5'末端，可翻译成含有499个氨基酸的蛋白质。

2．2 PLAGL1 PLAGL1(也称为 LOT1或 ZAC1)的 DNA 结合结构域中显示出与PLAG1的高度同源性，但这两种蛋白的DNA结合特异性略有不同。人PLAGL1/ZAC位于与生长抑制相关的染色体6q24～25上，长度≥70kb，并在许多实体肿瘤中缺失。PLAGL1具有与p53相似的抑制肿瘤细胞生长的能力［8］。PLAGL1含有5个外显子，前三个外显子不可翻译，第四个外显子含有ATG起始密码子，第五个外显子含有TAA终止密码子。PLAGL1蛋白由463个氨基酸编码，N端含有7个C2H2锌指结构域，C端富含丝氨酸和脯氨酸。上述结构可能与其诱导细胞周期停滞和凋亡有关。

2．3 PLAGL2 PLAGL2 位于染色体 20q11．1，其编码蛋白包括496个氨基酸，相对分子质量55kD，N端含有6个C2H2锌指结构域，C端富含脯氨酸和丝氨酸，N端的锌指结构为DNA结合序列，其结合位点包含一个核心序列和一个G-簇序列，并被7个随机核苷酸分开。C端主要参与转录激活。相比于PLAG1和PLAGL1，PLAGL2在肿瘤的发生发展过程中的作用及其潜在的致癌机制目前研究还很少。

3 PLAG家族的转录调控机制

PLAGL1是印迹基因，在发育过程中，PLAGL1在各种组织中仅由父本等位基因表达，与绝大多数印迹基因一样，富含CpG序列的差异甲基化区域(DMR)参与其转录的调节，体外试验证明CpG岛的甲基化诱导抑制基因转录的异染色质修饰［9］。除P1启动子外，PLAGL1转录本也可来自两个额外的启动子，P1上游的P2启动子位于未甲基化的CpG岛上，P3启动子位于独特区域，该区域产生的转录本只含有该基因的最后3个外显子。除了以上3种转录产物之外，PLAGL1区域编码两种非编码RNA(ncRNA)，HYMAI和PLAGL1it，它们在将组蛋白甲基转移酶募集到启动子和与染色质相互作用中发挥着重要的作用。染色体3p21上的CTNNB1基因作为转位伴侣，参与PLAG1的染色体易位。在正常情况下，CTNNB1基因编码参与细胞-细胞黏附和WNT-β-catenin信号转导途径，在细胞中普遍表达。而PLAG1仅在胎儿组织中普遍表达，染色体易位后，受活性CTNNB1启动子驱动，PLAG1异位过表达。已有报道，PLAG1在多个赖氨酸残基上发生苏酰化(sumoylation)，且苏酰化对PLAG1的转录能力具有明显的抑制作用。PLAG1和PLAGL2通过乙酰化(acetylation)修饰，靶向相同的赖氨酸残基并抑制其反式激活能力。PLAG1和PLAGL2转录激活机制相似，二者都只在胎儿组织中转录后表达，而PLAGL1在胎儿和成人组织中普遍表达，是生长因子信号通路作用的靶标，PLAGL1在许多类型的人类肿瘤中被抑制。

PLAG家族蛋白在N端具有高度同源的C2H2锌指结构，是蛋白质-DNA识别中起主要作用的结构域，可以识别含GRGGG(N)6-8RGGK片段的DNA，C端结构域具有反式激活能力，以上结构特点证明PLAG家族蛋白具有转录调节因子的功能。PLAG家族在结构上高度同源，但功能不同，这与其结合的DNA结构域不同有关。PLAG1和PLAGL2特异性识别并瞬时激活DNA结合域共有序列的转录，该序列由核心序列(GRGGC)和G-簇(RGGK)组成，中间被6～8个随机核苷酸分隔开。两个非连续的锌指结构域是结合的关键，其中，锌指结构域3识别G-簇，锌指结构域6，7识别核心序列。

4 PLAG家族与癌症

4．1 PLAG家族与胃癌 在胃腺癌(gastricadenocarcinoma，GAC)患者组织样本中，检测到PLAGL1基因的缺失和启动子的高甲基化。在该研究中，12．4%的GAC样本检测出PLAGL1基因的拷贝数丢失，并与其mRNA转录水平密切相关。已报道，PLAGL1基因的启动子超甲基化与许多人类恶性肿瘤密切相关，由于在GAC中未检测到P2启动子的甲基化，所以PLAGL1主要由P1启动子驱动。研究者在GAC样品中检测PLAGL1基因的P1启动子上存在13个潜在CpG位点，P1启动子的甲基化抑制PLAGL1的表达。亚硫酸氢盐测序证明了启动子甲基化状态和PLAGL1mRNA转录水平之间的强相关性［10］。

4．2 PLAG家族与白血病 Landrette等［11］证实，急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)与16号染色体的频繁倒置产生编码融合蛋白CBFβ-SMMHC的CBFB-MYH11融合基因密切相关。PLAG1和PLAGL2在小鼠体内独立的与CBFβ-SMMHC协同作用，在短时间内有效的诱导白血病。PLAG1和PLAGL2通过诱导细胞从G1期向S期转化，促进细胞增殖，引起造血祖细胞的扩增，增强细胞体外自我更新能力，研究表明，PLAG1和 PLAGL2通过扩增表达 CBFβ-SMMHC的造血细胞参与急性髓系白血病的发生发展。

miRNA(microRNA)是一种长度为19～25个碱基的非编码小RNA，可通过与下游靶基因mRNA的3'UTR区结合引起其翻译抑制或mRNA降解，在转录或转录后发挥负调控作用。多项研究表明miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、转移、血管新生及肿瘤发展中均发挥重要作用。同时在多种造血系统恶性疾患中存在miRNA的异常表达，参与恶性血液病的发生和化疗耐药过程。研究发现，PLAG1表达受miR-107、-141、-155、-181a、-181b 和-424 的调控。由于启动子的高甲基化，一些miRNA的转录沉默被认为是导致PLAG1过表达的原因，最终导致慢性淋巴细胞白血病的发生发展。在慢性淋巴细胞白血病患者B细胞中，PLAG1mRNA水平与健康供体B细胞并无差异，但 PLAG1蛋白水平却上调，提示miRNA主要通过翻译抑制而非mRNA转录抑制来调控PLAG1。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要由免疫细胞表达，属于肿瘤坏死因子超家族成员。TRAIL通过与凋亡诱导受体TRAIL-R1和TRAIL-R2结合，激活内源性和外源性凋亡通路来特异性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞毒性较低，在肿瘤治疗中拥有良好的应用前景。研究表明多数人类肿瘤细胞包括白血病细胞对TRAIL原发或继发耐药，极大程度限制了TRAIL的临床应用。然而，TRAIL耐药的发生机制仍有待进一步阐明。miR-424和27a过靶向PLAG1的3'UTR抑制了PLAG1的表达，PLAG1的下调增加AML细胞对TRAIL诱导的凋亡的敏感性。进一步研究发现PLAG1作为转录因子可以增强Bcl2启动子活性，使其在mRNA水平上调，PLAG1通过转录激活Bc12发挥抗凋亡作用，即同时干扰内源性和外源性凋亡通路，阻断caspase-3、caspase-8和PARP的激活。因此，miR-424、miR-27a具有抑制 PLAG1的功能，可能作为克服AML耐药治疗的新靶点［12］。

4．3 PLAG家族与肝癌 PLAG1基因与肝母细胞瘤有关，与正常肝组织相比，PLAG1在20个肝母细胞瘤中有19个高表达。PLAG1mRNA转录水平在肝母细胞瘤肿瘤中比正常肝脏高3～12倍，与胎儿肝脏组织中的表达水平相当。荧光素酶报告基因系统检测证明在肝母细胞瘤衍生的细胞系中，PLAG1反式激活来自胚胎IGF-Ⅱ启动子P3的转录，同时在几乎所有肝母细胞瘤中都检测到IGF-Ⅱ的上调［13］。

核转运蛋白α2(karyopherinα2，KPNA2)是核转运家族蛋白之一，可以作为衔接蛋白与核转运蛋白1形成异二聚体，促进核蛋白导入。已知过表达的KPNA2可以促进肝癌(hepatocarcinoma，HCC)细胞的增殖，Hu 等［14］证实 PLAG1可通过与KPNA2相互作用而进入细胞核，在临床样本中观察到KPNA2和PLAG1在细胞核中的共定位。敲低PLAG1可以显著抑制KPNA2对细胞增殖和转移能力的促进。PLAG1和KPNA2可被用来预测肝切除术后HCC患者的预后。

付琳等［15］检测106例临床血浆样本，在肝癌组，肝硬化组和健康对照组分别检测到71．4%、23．5%和6．7%的PLAG1 mRNA高表达。肝癌组PLAG1mRNA表达水平显著高于肝硬化组和健康对照组。揭示肝癌患者血浆中PLAG1mRNA的表达水平可作为肝癌诊断和转移的新型肿瘤标志物。

PLAGL1在肝癌细胞系中的转录水平显著低于正常成纤维细胞，但并未检测到蛋白表达水平的差异，PLAGL1与P53基因转录在正常细胞增殖期间互相协调，而在癌细胞中受到干扰。推测肝癌发生过程中可能存在PLAGL1蛋白的异常转运［16］。

4．4 PLAG家族与神经系统肿瘤 胶质母细胞瘤具有强大的自我更新能力和不成熟的分化特征，这也与其可塑性和治疗抗性有关。Zheng等［17］通过对18例临床原发性胶质瘤样本和20种胶质母细胞瘤细胞系的研究证实PLAGL2通过上游Wnt抑制蛋白 Dickkopf-1(DKK1)和 Wnt受体蛋白Frizzled(Fzd2，9)对 Wnt/β-catenin信号通路进行调控，进而促使神经脑胶质瘤细胞的自我更新，PLAGL2作为神经脑胶质瘤的癌基因不断赋予癌细胞干细胞样特性。这一发现提示我们，PLAGL2作为具有调控细胞分化和自我更新能力的胶质母细胞瘤致癌基因，是恶性胶质瘤治疗的很好的靶标。

4．5 PLAG家族与结肠癌 结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是最常见的具有异质生物和遗传特征的恶性肿瘤之一。基于5-氟尿嘧啶(5-Fu)的辅助化疗对于CRC患者是一种有效且常用的疗法，但只有不到25%的晚期CRC患者能响应该治疗，对5-Fu的耐药性是CRC化疗的主要障碍。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)是具有典型临床病理特征的CRC亚型。MSICRC具有更强的致癌作用和5-FU抗性，潜在的分子机制仍不清楚。Shi等［18］研究发现MSICRC的超甲基化引起了miR-181a/135a/302c的减少，而miR-181a/135a/302c通过抑制PLAG1/IGF2信号传导增强CRC细胞对基于5-Fu的辅助化疗的敏感性。该研究有助于我们更好地了解MSICRC中的化学耐药机制，为开发CRC患者的生物标志物和治疗靶点提供线索。

Wang等［19］研究证实PLAGL2过表达可以显著上调间充质标记蛋白，N-钙粘蛋白和波形蛋白，同时下调E-钙粘蛋白，诱导肿瘤上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是癌症预后不良相关的独立预测因子。Liu等［20］证实通过激活PLAGL2/IGF2/-连环蛋白信号通路可以促进CRC的增殖、迁移和转移。PLAGL2作为原癌基因在CRC中过表达，并且它可以通过与Wnt6的启动子区域结合而激活Wnt/β-连环蛋白信号通路［21］。肠上皮干细胞(intestinalepithelialstemcell，IESC)由两种主要的转录调节因子TCF4/β-连环蛋白复合物和ASCL2进行调节，这两种主要的转录因子促进IESC特异性因子的表达，包括Lgr5、Ephb2和Rnf43。PLAGL2通过激活Wnt基因表达，增强肠道器官中的TCF/LEF基因转录，并且直接增强ASCL2的表达，促进肠上皮干细胞样的特征。PLAGL2还在Wnt配体耗竭时促进肠细胞的生长，这一发现提示我们，PLAGL2的表达与CRC中的肠上皮干细胞特征密切相关，可能是治疗结直肠癌的相关靶标［22］。DJ-1是PARK7基因编码的肽酶C56蛋白家族的一个成员，它可以作为一个正向的雄激素受体介导的转录调节因子，也可以用作氧化还原敏感的分子伴侣，作为氧化应激的传感器。研究表明DJ-1可以通过激活PLAGL2-Wnt-BMP4信号通路来促进CRC转移，这也为CRC患者的术后辅助治疗提供了新的治疗靶点［23］。

已证实PLAGL1在CRC中表达下调，并且较低的mRNA和蛋白水平与CRC转移进展相关［24］。

4．6 PLAG家族与膀胱癌 Qu等［25］对203例膀胱尿路上皮癌切除术患者的临床样本进行检测，发现PLAGL2在膀胱尿路上皮癌的表达显著高于正常膀胱组织，PLAGL2高表达患者的复发时间和总生存期显著低于PLAGL2低表达患者。因此，研究者认为PLAGL2表达可以作为膀胱尿路上皮癌切除术患者无复发生存期(relapsefreesurvival，RFS)和总生存期(overallsurvival，OS)的预测指标。

4．7 PLAG家族与前列腺癌 Guo等［26］研究发现PLAGL2在前列腺癌患者临床样本和前列腺肿瘤细胞系中表达显著升高。PLAGL2前列腺癌患者生化复发(biochemicalrecurrence，BCR)和总生存期(overallsurvival，OS)的独立预后因素，过表达PLAGL2患者的生化复发早期发展和总生存期短。这项研究表明PLAGL2表达增加与前列腺癌患者切除术后的病情进展相关，并且可能作为前列腺癌的新的不良预后标志物。Jacobs等［27］在前列腺癌患者组织样本中，检测到PLAGL1基因的缺失和启动子的高甲基化。

4．8 PLAG家族与肺癌 LKB1(liverkinaseB1)是一种多功能激酶，可以通过激活代谢调节因子AMP依赖的蛋白激酶［Adenosine5'-monophosphate(AMP)-activatedprotein kinase，AMPK］来抑制真核细胞生长调节因子 mTORC1，LKB1的缺失与肺癌的高转移和预后不良有关。已有报道AMPK在不同肿瘤微环境可以发挥抗癌或促癌作用，AMPK抑制mTORC1活性，使细胞周期阻滞于G0/G1期，细胞生长、增殖停滞，且诱导细胞凋亡，使肿瘤生长停滞或消退。但肿瘤微环境不适合癌细胞增殖的情况下，AMPK介导细胞存活使其脱离基质进入血液循环［28］。在脱离基质过程中，PLAG1上调并激活谷氨酰胺酶谷氨酸脱氢酶1(glutamate dehydrogenase1，GDH1)启动子，而 PLAG1敲低则降低了GDH1表达并增加了失巢凋亡。PLAG1介导的GDH1的表达增强激活CamKK2及其下游底物AMPK，为肺癌细胞提供抗失巢凋亡和促转移信号传导。在LKB1缺失的细胞中GDH1表达上调，GDH1介导CamKK2-AMPK信号通路激活，AMPK抗失巢凋亡和促进肿瘤转移，在没有LKB1缺失的细胞中GDH1发挥不了以上作用。因此靶向PLAG1-GDH1信号通路是预防LKB1缺失性肺癌转移发展的潜在治疗靶点［29］。

Yang等［30］证实PLAGL2过表达引起末端细支气管和支气管肺泡管连接处表达pro-SP-C和Clara细胞分泌蛋白(claracellsecretoryprotein，CCSP)的上皮细胞增加。通过公共肺癌基因表达谱数据库分析显示，人PLAGL2表达与肺腺癌呈相关性，且在女性患者中，PLAGL2的表达与患者存活预后呈负相关，即高表达PLAGL2的女性患者预后较差，而男性患者中无此相关性。因此，研究者们认为PLAGL2可以作为肺腺癌发展和判断预后的新指标。

4．9 PLAG家族与肾癌 许多儿童期Wilms肿瘤是由microRNA发生突变引起的，但这些突变引发肿瘤发生机制尚不明确。Chen等［31］发现 PLAG1是这些 microRNA的靶基因，并且在Wilms肿瘤中过表达。Wilms肿瘤中PLAG1拷贝数增加，PLAG1表达水平与Wilms肿瘤的预后相关。PLAG1过表达在体外加速Wilms肿瘤细胞的生长，并在体内诱导发育中的小鼠肾脏的肿瘤生长。PLAG1激活关键的Wilms肿瘤致癌基因IGF2，并驱动mTORC1信号传导通路的靶蛋白。以上研究将microRNA突变与PLAG1-IGF2信号通路联系起来，为解释Wilms肿瘤突变驱动疾病发病机制提供了新的见解。

5 展望

由于PLAG家族在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，因此成为分子生物学研究的重点，特别是PLAG家族成员PLAG1和PLAGL2在急性髓系白血病，肝癌，结直肠癌中的研究进展，确立了其作为肿瘤潜在治疗靶点的价值。然而还有许多问题亟须解决，如尚未发现PLAG家族成员及其靶分子在治疗临床恶性肿瘤潜在药物靶点，PLAG家族成员是否参与对肿瘤微环境的调控等科学问题。深入研究PLAG家族成员在肿瘤中的作用机制，很可能为肿瘤的治疗提供新的突破。