HPLC法同时测定复方阿胶补血颗粒中4种氨基酸

尹宁宁，郭东晓

(1．山东省食品药品审评认证中心，山东济南250014;2．山东省食品药品检验研究院，山东 济南250101)

复方阿胶补血颗粒由阿胶、熟地黄和党参3味药组成，具有补气养血的功效，用于气血两虚所致的倦怠乏力、面色无华、头晕目眩、失眠多梦、心悸气短等症，以及缺铁性贫血见上述证候者。复方阿胶补血颗粒是湖南东健药业有限公司独家生产品种，最早收载于《安徽省药品标准》(1987年)，原名“阿胶冲剂”。1992年5月14日湖南省药政局批准生产。2002年11月30日地标升国标，由原国家食品药品监督管理局批准为“复方阿胶补血颗粒”，收载于《国家中成药标准汇编》内科气血津液分册，标准号为WS-10319(ZD-0319)-2002。该标准含量测定项下仅收载总氮量的测定，方法专属性较差。参照《中国药典》2015年版阿胶含量测定项下［1］以及相关文献［2-10］，本文研究建立了处方药味阿胶中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的HPLC含量测定方法，提高了含量测定方法的专属性。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪;MettlerAE240电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品，购自中国食品药品检定研究院，批号分别为111578-200201、140689-200401、140680-200401、140677-200405;乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。复方阿胶补血颗粒收集自湖南东健药业有限公司，规格为每袋装20g，批号分别为 20090101、20090103、20090701。

2 方法与结果

2．1 溶液的制备

2．1．1 混合对照品溶液的制备 精密称取L-羟脯氨酸对照品 9．73mg、甘氨酸对照品 18．14mg、丙氨酸对照品 8．12mg、L-脯氨酸对照品 13．31mg，加 0．1 mol·L-1盐酸溶液使溶解并定容至50mL。精密量取 3mL，置 10mL 量瓶中，加 0．1mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得混合对照品溶液，每1 mL 含 L-羟脯氨酸 58．38 μg、甘氨酸 108．84 μg、丙氨酸 48．72 μg、L-脯氨酸 79．86 μg。

2．1．2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约2．5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0．1mol·L-1盐酸溶液 20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，加0．1mol·L-1盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2mL，置5mL安瓿中，加盐酸2mL，150℃水解1h，放冷，移至蒸发皿中，用水10mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加 0．1mol·L-1盐酸溶液溶解，滤过，滤液转移至25mL量瓶中，加0．1mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2．1．3 阴性对照溶液的制备 取处方中除阿胶以外的其他药味，照处方的组成和比例制成不加阿胶的阴性对照样品，并按“2．1．2”项下方法制成阴性对照溶液。

2．1．4 衍生化溶液的制备 精密量取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5mL，分别置25mL量瓶中，各加0．1mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液 2．5mL，1mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2．5mL，摇匀，室温放置1h后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10mL，加正己烷10mL，振摇，放置10min，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

2．2 色谱条件及系统适用性试验 WatersSunfire C18色谱柱(4．6mm×250mm，5 μm);以乙腈-0．1 mol·L-1醋酸钠溶液(用36%乙酸调节pH值至6．5)(7∶93)为流动相A，以乙腈-水(4∶1)为流动相B，梯度洗脱(0～13min，100%A →93%A;13～17．9 min，93%A →88%A;17．9～29min，88%A →85%A;29～39min，85%A →66%A;39～45min，66%A →0%A);流速 1．0mL·min-1;测定波长 254nm;柱温 43℃;分别吸取“2．1．4”项下各溶液的衍生化溶液，进样量5μL。在上述条件下，4种氨基酸的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1．5，理论板数均大于6000。样品中其他成分对4种目标成分的测定没有干扰，色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2．3 含量测定方法学验证

2．3．1 线性关系考察 精密吸取“2．1．4”项下混合对照品溶液的衍生化溶液各 1、2、3、4、5、10 μL，按“2．2”项下色谱条件进行测定，以各成分进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归。结果在相应进样量范围内，4种成分线性关系良好，结果见表1。

2．3．2 精密度试验 精密吸取“2．1．4”项下混合对照品溶液的衍生化溶液5μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，结果L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面积的 RSD 分别为0．4%、0．4%、0．5%、0．4%。结果表明仪器的精密度良好。

2．3．3 稳定性试验 取“2．1．4”项下复方阿胶补血颗粒供试品溶液(批号：20090103)的衍生化溶液分别于 0、2、4、6、8、12h 分别进样 5 μL，结果 L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面积的RSD分别为 0．7%、0．4%、0．4%、0．6%。表明供试品溶液中的4个待测成分在室温放置12h内稳定性良好，能够满足测定需要。

2．3．4 重复性试验 取复方阿胶补血颗粒样品(批号：20090103，平均装量 20．2307g)，按照“2．1．2”项下方法，平行制备 6份供试品溶液，然后按照“2．1．4”项下方法，分别制备上述供试品溶液的衍生化溶液，进样5μL进行测定。结果L-羟脯氨酸平均含量为 143．5mg/袋，RSD 为 0．7%;甘氨酸平均含量为 279．8mg/袋，RSD 为 1．9%;丙氨酸平均含量为109．0mg/袋，RSD 为 1．7%;L-脯氨酸平均含量为172．0mg/袋，RSD 为 1．0%。结果表明该测定方法的重复性良好。

2．3．5 加样回收率试验 取“2．3．4”项下已测定含量的复方阿胶补血颗粒(批号：20090103)粉末约1．25g，共取6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品适量，按照“2．1．2”项下方法自“精密加入 0．1 mol·L-1盐酸溶液20mL”起，同法制备供试品溶液，然后按照“2．1．4”项下方法，分别制备上述供试品溶液的衍生化溶液，进样5μL进行测定，并计算4种待测成分的加样回收率，结果见表2。试验结果表明，含量测定方法回收率良好。

2．4 样品测定 取收集到的3批复方阿胶补血颗粒样品，按照“2．1．2”项下方法制备供试品溶液，然后按照“2．1．4”项下方法，分别制备上述供试品溶液的衍生化溶液，进样5μL进行测定。结果见表3。

表3 3批复方阿胶补血颗粒中4种氨基酸的测定结果

3 讨论

3．1 色谱柱的考察 对3个品牌的色谱柱进行考察，包括 WatersSunfireC18、迪马 KromasilC18、InertsilODS-3C18(均为4．6mm×250mm，5 μm)，结果对照品溶液和供试品溶液的衍生化溶液色谱图中，4种氨基酸色谱峰均有良好的对称因子、理论板数及分离度，表明该方法对色谱柱无选择性，适用范围广。

3．2 取样量的考察 分别取 2．0、2．5、3．0g 样品，精密称定，按照“2．1．2”项下方法制备供试品溶液，然后按照“2．1．4”项下方法，制备供试品溶液的衍生化溶液，进样测定。3种取样量的测定结果没有显著差异，但取样量为3．0g时，L-羟脯氨酸的峰形较差，为了确保分离效果，同时考虑到取样的均匀性，选择取样量为 2．5g。

3．3 检测结果的分析 《中国药典》2015年版阿胶药材含量测定项下，规定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸不得少于 8．0%、18．0%、7．0%、10．0%［1］。根据复方阿胶补血颗粒中阿胶的处方量(50g)、制剂的制成总量(1000g)、规格(每袋装20g)进行折算，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的理论含量分别为不得少于 80．0、180．0、70．0、100．0mg。按转移率为90%进行折算，建议规定本品含量限度为每袋含阿胶以L-羟脯氨酸计，不得少于72．0mg;以甘氨酸计，不得少于 162．0mg;以丙氨酸计，不得少于 63．0 mg;以L-脯氨酸计，不得少于90．0mg。收集的3批样品均符合上述规定。