马齿苋鲜品凝胶制备及其对小鼠湿疹的初步作用

杨佳丽，赵阳，杜丽，卢育新，程晓晨，潘自强，赵希荣* ，张庆林*

(1．淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安223003;2．军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京100850)

马齿苋(PortulacaoleraceaL．)为马齿苋科马齿苋属植物，一年生肉质草本生物，民间称其为长寿菜、蚂蚁菜、瓜子菜等。马齿苋鲜品含有生物碱、黄酮、多糖、多不饱和脂肪酸等成分，不仅具有很高的营养价值，而且具有提高人体免疫力、降血糖、降血脂、抗菌、治疗湿疹、丹毒、热毒血痢、痈肿疗疮等作用功效［1］。马齿苋被称为天然抗生素，据文献报道马齿苋黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。湿疹是常见的变态反应性炎症性皮肤病，病因复杂多样，其外部的细菌(如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等)及真菌感染会加重病情。由于湿疹病情反复，难以根治，严重影响患者的生活质量。在临床治疗中发现马齿苋对湿疹疗效显著，目前治疗湿疹采用的马齿苋多为干品，少有关于马齿苋鲜品对湿疹治疗的研究。马齿苋治疗急性湿疹通常采用外洗方，存在渗透性差、不易清洗等问题。在研究过程中发现马齿苋鲜汁提取物冻干品吸湿性较强，不易保存，限制了其使用。凝胶剂是一种常见的半固体制剂，由于本身的液体成分较多，可以克服鲜汁提取物吸湿性，具有黏附性好、渗透性强、易于清洗、患者易接受等优点，是常用的剂型之一。本研究将马齿苋鲜汁冻干品制成凝胶剂型，以卡波姆-940为主要载体，综合凝胶剂的感官指标和实验指标评分对马齿苋鲜品凝胶剂制备工艺进行多因素考察，并采用正交试验筛选出最佳处方。对马齿苋鲜品凝胶进行抑菌实验，观察凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用。通过动物实验，观察马齿苋鲜品凝胶对 2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitro-chlorobenzene，DNCB)所致小鼠急性湿疹模型的治疗作用，旨在开发马齿苋治疗湿疹的新剂型。

1 材料与方法

1．1 仪器 台式高速离心机(湖南湘仪，型号：H-1850R);pH计(MettlerToledo);光学显微镜(OlympusCX4lRF);-20℃低温冰箱(海尔冰箱);超净工作台(北京昌平仪器公司);隔水型恒温培养箱(天津泰勒斯特仪器公司);高压蒸汽灭菌锅(上海申安仪器公司)。

1．2 实验材料 卡波姆-940(上海麦克林生化科技有限公司);氧氟沙星胶囊(江西黄河药业);Tween-80(GFCOChemicalSupplies);复方黄柏液(江西盖天灵药业);羟苯乙酯、1，2-丙二醇、氮酮及 2，4-二硝基氯苯(DNCB)均购自国药集团化学试剂有限公司。金色葡萄球菌(ATCC25922)、大肠杆菌(ATCC29213)由本实验室保存。

1．3 实验动物 健康昆明小鼠40只，雌雄各半，体重(22±4)g，由军事医学研究院动物实验中心提供［合格证号：SCXK(军)2012-0004］，饲养于军事医学研究院动物实验中心。实验动物饲养环境温度保持在24℃左右，昼夜明暗交替时间为12h/12h，相对湿度保持在40%～70%;标准饲料和水供动物自由饮食。

1．4 马齿苋鲜品凝胶的制备 将采购自江苏的鲜马齿苋榨汁，榨汁液浓缩冻干。将马齿苋冻干品0．1 g、羟苯乙酯(少量无水乙醇溶解)0．1g、1，2-丙二醇5mL、Tween-800．1g 及氮酮 0．1g 置于研钵中研磨，研磨充分后加入凝胶基质搅拌［3］。用适量10%NaOH溶液调pH至6．5，总质量最终为50g。

1．5 马齿苋鲜品凝胶的优化

1．5．1 卡波姆的用量 按照“1．3”项下操作，设置不同浓度的卡波姆(0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%)，其他因素不变，平行制备5份凝胶剂，按照表1评分标准进行考察。

1．5．2 丙二醇的用量 按照“1．3”项下操作，设置不同浓度的丙二醇(5%、10%、15%、20%、25%)，其他因素不变，平行制备5份凝胶剂，按照表1评分标准进行考察［4］。

表1 卡波姆凝胶剂基质考察评分标准

1．5．3 pH 优化 按照“1．3”项下操作，以 10%NaOH 为调节剂，设置不同的 pH 值(4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5)，平行制备 5 份凝胶剂，按照表 1 评分标准进行考察。

1．6 凝胶剂质量检测 对于凝胶制剂处方评价的方式较为广泛，如果采用单一的感官评价指标对凝胶剂的处方进行评价会显得结果不够准确［5］。本实验在相关文献基础上，除了采用感官指标评价外，以理化指标(耐寒稳定性、耐热稳定性及抗菌性)对凝胶质量进行评价。

1．6．1 离心试验 取3批凝胶剂各5g置于离心管中，6000rpm离心15min取出，观察凝胶有无分层及颜色变化。

1．6．2 耐寒试验 取3批凝胶剂各5g置于-20℃冰箱中48h取出，观察凝胶有无分层及颜色变化。

1．6．3 耐热试验 取3批凝胶剂各5g置于55℃水浴中2h取出，观察凝胶有无分层及颜色的变化［6］。

1．6．4 凝胶剂抗菌活性 在无菌操作台中，将金色葡萄球菌和大肠杆菌摇床培养过夜，计数并稀释至106个/mL。吸取100μL稀释后的菌液均匀涂布在固体LB培养基上，晾干后用无菌的打孔器打孔(直径为7mm)。向孔内分别加30μL的生理盐水作为阴性对照、阳性药(氧氟沙星凝胶)，空白原位凝胶、马齿苋鲜品凝胶及冻干马齿苋(溶于生理盐水)各0．5g，置于37℃恒温培养箱中培养12h观察抑菌圈。

1．7 小鼠湿疹模型 将小鼠随机分为凝胶组、复方黄柏液组(HB组)、阴性对照组及正常组共4组，每组10只。在每只小鼠颈背部剪毛(面积2cm×2 cm)，除正常组外，其他3组小鼠去毛后当日及次日于去毛部涂5%DNCB(100μL/只)各一次致敏，第7天涂1%DNCB(100 μL/只)激发［7］。激发 24h后给药，复方黄柏液组涂抹复方黄柏液(500 μL·cm-2)，阴性对照组涂抹等量生理盐水，凝胶组涂抹0．5g马齿苋鲜品凝胶，每天2次，连用7d。

1．8 皮肤组织病理检查 给药7d后，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠湿疹模型部位皮肤组织，10%甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色。光学显微镜观察皮肤组织病理改变［9］。

2 实验结果

2．1 马齿苋鲜品凝胶的优化

2．1．1 卡波姆的用量 卡波姆的浓度为 0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%时，凝胶剂的评分分别为7．7、7．9、8．0、8．7、8．5，即卡波姆浓度为 0．7%最佳，结果见表2。

表2 不同浓度卡波姆凝胶基质的综合评分

2．1．2 丙二醇的用量 丙二醇的浓度为5%、10%、15%、20%、25%时，凝胶剂的评分分别为 8．0、8．6、8．4、9．0、8．3，据此选择丙二醇的浓度 20%，结果见表 3。

表3 不同浓度丙二醇凝胶基质的综合评分

2．1．3 pH pH 为 4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5 时，凝胶剂的评分分别为 5．8、8．4、9．0、8．4、7．9、4．6，pH 值为6．5时凝胶剂评分最高，结果见表4。

2．2 正交试验 根据以上单因素试验结果，选择卡波姆-940浓度(A)、丙二醇浓度(B)和pH值(C)作为考察影响凝胶剂的主要因素，每个因素设3个水平，按L9(34)正交表进行试验，因素水平见表5，正交试验结果见表6。

试验结果如表6所示，RA=RC＞RB各因素对试验指标影响的主次顺序是A=C＞B，即对凝胶剂影响较大的是卡波姆-940用量和pH。另外，正常皮肤是弱酸性的，表面pH一般维持在4．5～6．5。综合以上因素，最终采用的制备工艺为A2B1C2，即卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5。

表4 不同pH凝胶基质的综合评分

表5 因素水平表

表6 正交设计表

2．3 验证试验 用正交试验优选的工艺条件卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5 平行制备 3 批凝胶剂，综合评分分别为 9．3、9．4、9．0。结果表明该制备工艺稳定，后续实验均采用此处方。

2．4 抑菌实验 对金色葡萄球菌的抑菌实验结果显示(见图1A)，马齿苋鲜品凝胶、马齿苋干品提取物和阳性对照均有抑菌圈出现，马齿苋鲜品凝胶的抑菌圈明显大于马齿苋干品提取物，阴性对照和空白原位凝胶无抑菌圈;对大肠杆菌的抑菌实验显示(见图1B)，马齿苋鲜品凝胶和阳性对照孔有抑菌圈，而冻干马齿苋、阴性对照和空白原位凝胶无抑菌圈出现。实验结果表明，马齿苋鲜品凝胶保留了马齿苋的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑制作用，而凝胶的抑菌作用可以帮助减缓湿疹的症状。

图1 对金色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验结果

2．5 对小鼠急性湿疹治疗研究 小鼠急性湿疹模型建立结果显示，DNCB激发后阴性对照组皮肤出现红肿、糜烂面、有明显浆液性渗出，表明造模成功;HB组及马齿苋鲜品凝胶组背部红肿、糜烂等现象减轻，表明马齿苋鲜品凝胶可以缓解急性湿疹的症状(见图2)。光学显微镜观察皮肤病理切片显示(见图3)，阴性对照组表皮增厚，颗粒层轻度肥厚，棘层细胞内水肿，真皮内炎细胞(淋巴细胞)浸润明显，符合急性湿疹病理改变。HB组棘层细胞内轻度水肿，真皮内有少量炎细胞浸润，较阴性对照组症状明显减轻。马齿苋鲜品凝胶组颗粒层肥厚症状改善、棘层细胞内水肿明显改善，真皮内炎细胞数量明显减少。实验结果显示，马齿苋鲜品凝胶可以有效抑制DNCB所诱发的小鼠急性湿疹反应，明显减轻急性湿疹小鼠皮肤组织的炎症反应，表明马齿苋鲜品凝胶对急性湿疹有明确疗效。

图2 小鼠湿疹模型

3 讨论

图3 小鼠湿疹皮肤病理切片(HE，100×)

凝胶制剂系指药物与能形成凝胶的辅料制成均一、混悬或乳状液型的稠厚液体或半固体制剂。本研究首次将鲜品马齿苋用于凝胶制备，解决了鲜品马齿苋冻干品吸湿性强的问题。在凝胶剂制备中卡波姆-940用量会影响凝胶黏度和药物释放，pH值对外观形状有重要影响，丙二醇可作为凝胶剂的助溶剂和保湿剂，因此实验中考察了不同卡波姆-940浓度、pH值及丙二醇浓度对凝胶剂质量的影响。通过正交试验，确定凝胶剂的最优配方即0．7%卡波姆，10%丙二醇，pH6．5。对优化的马齿苋鲜品凝胶进行了质量检测，结果显示制备的马齿苋鲜品凝胶剂经离心、耐寒及耐热实验，稳定性良好，无分层及颜色变化。抑菌实验结果显示，凝胶剂型保留了马齿苋的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有明显抑制作用，而凝胶剂的抑菌作用可以缓解湿疹的症状。

中医认为湿疹多是由于风、湿、热邪郁于局部，与气血相互搏结形成，故选用清热解毒，散血消肿等药物治疗。在湿疹的发病中以急性湿疹最为常见，发病时皮肤出现红斑、丘疹、水泡、糜烂、渗出，往往伴有剧烈的瘙痒［11］。有文献报道马齿苋可用于治疗急性湿疹［10］，因此为了研究马齿苋鲜品凝胶剂对湿疹的治疗作用，采用DNCB反复激发建立了小鼠湿疹模型。马齿苋鲜品凝胶涂抹给药后，皮肤病理结果显示，马齿苋鲜品凝胶治疗后湿疹皮肤的炎症反应明显减轻，表明马齿苋鲜品凝胶对小鼠湿疹具有治疗作用。

综上所述，本研究通过优化成功制备了马齿苋鲜品凝胶，抗菌实验表明马齿苋鲜品凝胶保留了马齿苋的抑菌活性，进一步的动物实验也表明其对小鼠湿疹具有明显的治疗作用，为马齿苋治疗湿疹研究提供研究基础。然而，对马齿苋鲜品凝胶剂的剂型研究，如体外释药、离体皮肤透皮等以及马齿苋鲜品的有效成分等均有待于进一步研究。