非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定

官丽娟 ，邵 钰，任伟杰，宫枫举，韩同福，邹艳丽，孙学强，，吴晓东，张 志，，黄保续

（1.青岛立见诊断技术发展中心，山东青岛 266114；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性、热性、烈性动物传染病，病死率高达100%[1]，严重危及养猪业发展。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告疫病，我国将其列为一类传染病[2]。ASFV 是一种大型的胞质内复制的病毒，由核质体、核衣壳、内层囊膜和外层囊膜构成。ASFV 基因组庞大，可达171～193 kb，有150多个主要开放阅读框，编码约200种蛋白[3]，其中抗原性较强的结构性蛋白主要为p54、p220、p62、p72、p32以及CD2v 等[4]。研究发现，由基因E183L编码的p54蛋白抗原性较好，它在快速入侵、吸附易感细胞中发挥很大作用，且病毒进入机体后可产生针对于该蛋白的抗体[5-7]。因此，一些学者针对p54蛋白建立了ASFV 抗体检测方法，用于ASFV 感染动物血清的监测[8-9]。2018年8月，我国报告首例ASF 疫情，随后又陆续暴发超百起疫情，给我国养猪业带来了巨大损失[10-11]。尽管国内外已有许多研究报道了p54蛋白编码基因的表达，但其均是基于国外毒株开展的研究。本研究拟以我国暴发流行的ASFV（AnhuiXCGQ）作为研究对象，通过密码子优化后，用原核表达的方法，表达E183L基因的整个CDS 区，以期深入研究我国ASFV 流行毒株p54蛋白的抗原特性，并以此为基础建立相应的血清学诊断方法。

1 材料与方法

1.1 样品来源

ASFV 抗原、ASFV 阳性核酸和阳性血清，均由中国动物卫生与流行病学中心验证和提供。

1.2 主要试剂

Ex-Taq酶、BL21（DE3）感受态细胞、限制性内切酶NdeI 和HindⅢ，购自TaKaRa 生物技术有限公司；pET-30a（+），购自Novogen 公司；小量质粒提取试剂盒，购自天根生物有限公司。

1.3 p54基因特异性引物设计和序列扩增

根据GenBank 中ASFV 中国株（China 2018/AnhuiXCGQ）p54基因序列[12-13]，设计合成1对针对整个蛋白质编码区（CDS 区）的特异性PCR扩增引物。上游引物为：5'-CATATGATGGATTCT GAATTTTTTCA-3'；下游引物为：5'-AAGCTTTTA CAAGGAGTTTTCTAGGT-3'。扩增E183LCDS 区片段，使扩增目的基因长度为552 bp。扩增程序采用：94 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。在这对引物的5'端分别添加限制性内切酶NdeI 和HindⅢ 酶切位点，然后以ASFV 阳性核酸为模板进行核酸扩增；将扩增完的条带切胶后，通过DNA 纯化回收试剂盒回收，送生物公司测序，同时与E183L基因序列作比对。

1.4 pET-30a（+）-p54重组表达载体构建

上述扩增的p54 PCR 产物与pET-30a（+），同时用限制性内切酶NdeI 和HindⅢ 进行双酶切，用DNA 纯化回收试剂盒回收目的条带；通过T4 DNA 连接酶，将双酶切过的p54与pET-30a（+）表达载体连接过夜，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，并分别用p54基因对应的上述引物进行菌液PCR 鉴定。同时，将挑选出的阳性克隆菌株，通过小量质粒提取试剂盒提取质粒后，通过限制性内切酶NdeI 和HindⅢ 进行双酶切鉴定。

1.5 p54蛋白表达

取50 μL pET-30a（+）-p54阳性菌液按1：1 000接种到5 mL 含卡那霉素的LB 培养液中，37 ℃振荡培养过夜；以1：100比例，将扩增好的菌液接种到LB 培养液中培养；当培养液中的OD 值为0.5时，加IPTG 至终浓度0.8 mmol/L，37 ℃条件下继续诱导表达5 h；将培养物离心，弃去上清，加入蛋白质裂解液进行裂解；继续离心，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.6 p54表达蛋白纯化

根据1.5中蛋白表达的结果，取上清液进一步通过His 亲和层析柱亲和纯化重组p54蛋白。

1.7 可溶性表达蛋白鉴定

将纯化好的重组p54蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳结束后进行Western Blot：将蛋白凝胶转印至PVDF 膜，以5%脱脂奶粉封闭；将ASFV 阳性血清1：800倍稀释后孵育1 h，洗涤5次；以HRP 标记的抗猪二抗1：2 000稀释后孵育1 h，洗涤5次；最后加入DAB 显色，观察重组p54蛋白的反应原性。

2 结果

2.1 p54蛋白目的基因扩增

以ASFV 核酸为模板，用本研究设计的1对引物进行PCR 扩增，可以扩增出大小为552 bp 的特异性条带（图1）。扩增结果显示，该条带序列与GenBank 中ASFV p54基因同源性为100%，表明扩增片段确为ASFV 的p54基因序列。

图1 目的基因扩增结果

2.2 重组质粒pET-30a（+）-p54构建

对扩增得到的p54特异性片段与pET-30a（+）载体进行NdeI 和HindⅢ 双酶切，经过连接、转化、蓝白斑筛选后，挑选了8个白色菌落，摇菌后进行PCR 鉴定，结果发现8个白色菌落中有6个为阳性，特异性条带大小为552 bp（图2）。选出2个阳性克隆菌进行质粒提取，通过NdeI 和HindⅢ 双酶切鉴定，结果发现有5 kb 和0.5 kb 大小左右的特异性条带（图3）。

图2 重组质粒pET-30a（+）-p54琼脂糖凝胶电泳分析图

图3 重组质粒pET-30a（+）-p54双酶切鉴定结果

2.3 p54蛋白表达

重组原核表达质粒pET-30a（+）-p54转化感受态细胞BL21（DE3）后，为确定重组质粒的表达水平，采用两种不同的诱导和表达方式，即分别经过15 ℃诱导表达16 h 和37 ℃诱导表达4 h，再取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析。结果可见，两种诱导表达方式的上清和全菌中均出现一条分子量约为20 kDa 的特异性条带（图4），说明两种诱导方式都可以表达p54蛋白。其中，p54在37 ℃诱导表达4 h 比15 ℃诱导表达16 h 产生的蛋白量明显增高，p54蛋白在上清中的含量比在沉淀中明显增高。

2.4 p54蛋白纯化与鉴定

用His 亲和层析柱纯化37 ℃诱导表达后的细菌上清，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析，发现纯化的蛋白与预期蛋白大小一致，约为20 kDa 且纯度可达95%以上；进一步用Western Blot 进行鉴定，结果发现重组p54蛋白和阳性ASFV 抗原均与ASFV 阳性血清发生特异性反应，在20 kDa 处可以看到一条特异性棕黄色条带，且阴性样本不与ASFV 阳性血清发生反应（图5）。

图4 p54蛋白的表达鉴定结果

图5 p54蛋白纯化与鉴定结果

3 讨论

目前针对ASF 防控尚无有效的商品化疫苗，因此ASF 疫情的监测与诊断变得至关重要。根据OIE 和我国ASF 诊断技术国家标准，实验室检测ASFV 方法有血清学方法和病原学方法：血清学方法主要有间接酶联免疫吸附实验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验法；病原学检测方法有直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA 法、普通PCR 法和荧光PCR 法。我国在最新公布的《非洲猪瘟疫情应急实施方案（2019年版）》中指出，双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应等方法是检测ASFV 的病原学检测方法。

对ASFV 基因组分析表明，p54、p220、p62、p72、p32、CD2v、A104R、B602L、K205R等12种蛋白具有强抗原性，特别是p54、p72、p32、CD2v 等4种蛋白产生的抗体滴度较高，是检测ASFV 比较好的候选抗原成分[4]。Barderas 等[14]将具有强抗原表位的p54/p30嵌合在一起，结果证明其免疫原性和抗原性都很强。龚振华等[8]参考ASFV Con09/Bzz020株原核高效表达p54蛋白，并将其应用于ASF ELISA 检测中。冯春燕等[15]参考NCBI 中ASFV 的E75（GenBank：FN557520.1）毒株的p54基因序列，原核表达p54蛋白并成功制备p54单克隆抗体，进一步为ASFV ELISA 诊断技术的开发奠定了基础。梁云皓等[16]利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达ASFV p54蛋白，并通过Western Blot 证明其具有良好的抗原性。

基于以上研究，为避免形成包涵体和p54蛋白反应原性丢失，本研究根据GenBank 序列号ASFV（MK128995）通过密码子优化后，将E183L基因的CDS 区进行克隆表达，这不仅保留了完整的E183L基因表达产物，并且通过密码子优化，选择优于大肠杆菌表达的碱基，大大提高了p54蛋白的表达量。结果表明，本研究的表达策略是成功的。利用该方法，成功用原核表达载体pET-30a（+）获得了可溶性的p54抗原；经过Western Blot 鉴定后，发现纯化的p54可以与ASFV 阳性血清发生特异性反应；用BCA 蛋白测定方法，测定其浓度高达4 mg/mL，且纯化效率高。本研究为ASF ELISA诊断试剂的开发提供了参考。